全球登革病毒感染的流行现状及防治

全球登革病毒感染的流行现状及防治

[absu]devius是第四类最重要的退行性成员。它以缓慢、缓慢和缓慢的方式配置，而不是侧重于表面。在这一评论中，重点是对生命的授权。生活方式的转变，而不是侧重于表面授权和转化，而是一步一步的。登革病毒（denguevirus,DENV）是黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）的重要成员，是一类经蚊传播的单股正链RNA病毒，包括4个抗原性相关而又不同的血清型，分别被称为登革1～4型（DENV1～DENV4），均可引发从较温和的登革热（denguefever,DF）到严重的致死性的登革出血热（denguehaemorrhagicfever,DHF）和登革休克综合征（dengueshocksyndrome,DSS）等病症。登革热的流行已有200多年的历史，近20年来随着全球气候变暖和全球化带来的人口流动性增加，登革热的流行和暴发更为频繁，尤其在热带及亚热带地区，登革热和登革出血热的发病率及病死率均急剧上升。据统计，全球每年感染约1亿人，其中约50万人发展为DHF,25000人死亡。自1978年以来，我国南方和东南沿海地区多次暴发登革热及登革出血热。1999年和2004年，福建和浙江等地发生由输入性病例引发的登革热流行；2006年，广东省发生登革热疫情，共报告病例1019例。但目前登革热及登革出血热的发病机理仍不清楚，也缺乏安全有效的疫苗及特异的治疗药物。登革疫苗研究之所以进展缓慢，主要原因是DENV型别多，异型病毒二次感染常导致抗体依赖性感染增强（antibody-dependentenhancement,ADE），并且缺乏合适的动物评价模型。尽管如此，国内外不少实验室仍致力于登革新型疫苗特别是四价疫苗的研究，目前已取得一些进展，有多个四价疫苗进入临床研究阶段（表1）。我们着重介绍目前已经或正在进入临床研究阶段的四价登革减毒活疫苗的进展情况，并简要介绍灭活疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗和DNA疫苗的研究进展。1登革减毒活疫苗减毒活疫苗可以诱导与野生型病毒相似的体液和细胞免疫反应，具有很好的免疫原性和保护作用。疫苗制备成本亦相对较低，经优化后，疫苗株在Vero细胞中的病毒滴度可以达到107pfu/mL，每100mL病毒培养物可以制备100万份疫苗，在效价比方面明显优于其他类型的疫苗。因此，登革减毒活疫苗是目前最具应用前景的候选疫苗。减毒活疫苗筛选应遵循以下原则：(1)可诱导与野生型病毒相似的体液免疫和细胞免疫反应；(2)无明显的不良反应或不良反应在可接受的范围之内；(3)不会在蚊体内复制或复制水平受限，叮咬人后不足以诱发感染；不会发生蚊、人和低等灵长类动物间不同准种（quasispecies）病毒的大范围病毒基因重组；(4)对人的组织细胞高度易感，低剂量接种即可达到预期效果；(5)4个型疫苗配伍后的单剂免疫后可诱导针对4个型登革病毒的有效、持久、均衡的免疫反应；(6)减毒疫苗候选株的遗传背景应尽可能清楚，减毒机理明确，减毒表型稳定，并在疫苗制备及应用的各阶段均可进行质量监控。基于以上原则，对正在研发的四价减毒活疫苗介绍如下。1.1价疫苗的遗传稳定性美国WalterReed陆军研究所和GlaxoSmithKline公司利用GSK:GlaxoSmithKline;NIAID:NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases;NIH:NationalInstitutesofHealth;WRAIR:WalterReedArmyInstituteofResearch在PDK、PGMK等细胞中传代减毒的方法构建了4个型的减毒株，单价的疫苗候选株经猴动物实验和Ⅰ期临床实验证实获得了均衡的减毒和免疫原性表型。人体实验表明，DENV2、DENV3和DENV4具有较温和的反应原性；DENV1诱发的反应原性较强，40%的受试者出现发热和红疹症状。用配伍的四价疫苗单剂免疫登革病毒检测阴性的受试者，4个型别的血清转化率达到40%～100%，其中DENV1最高，DENV4最低，可能存在减毒不适度问题。经进一步优化，用PDK-27替代PDK-20对DENV1进一步传代减毒，用PDK-6替代PDK-20传代提高DENV4的免疫原性，重新配伍平衡后的四价疫苗正在北美和东南亚地区进行Ⅱ期临床实验。除了DENV2PDK-53疫苗候选株外，泰国Mahidol大学和美国WalterReed陆军研究所利用传统传代减毒方法构建的四价减毒活疫苗均未进行减毒表型及遗传背景鉴定，这给疫苗的遗传背景分析和疫苗衍生株特性分析带来困难。泰国Mahidol大学疫苗发展中心将亲本病毒在原代狗肾（PDK）细胞、原代绿猴肾（PGMK）细胞和幼猴肺细胞（FrhL）中传代减毒，获得了4个型的减毒株DEN1PDK13、DEN2PDK53、DEN4PDK48和DEN3PGMK30F3。自20世纪90年代初期以来，与法国AventisPasteur公司联合进行了单价、双价、三价和四价疫苗的随机双盲人体临床试验。但由于在随后的临床研究中发现不能诱导有效、持久、均衡的免疫反应，而且在四价疫苗临床实验受试者中发生了一系列的不良反应，现对该疫苗的评价已终止。1.2denv的病毒关联疫苗利用反向遗传学技术制备减毒活疫苗具有显著的优点：第一，减毒株构建方法相对简便，重复性好，与传统减毒法相比，疫苗研究周期缩短；第二，减毒株遗传背景清楚，减毒表型明确，利于对疫苗制备及应用的各阶段进行质量监控；第三，随着对病毒致病机理和复制翻译机制研究的不断深入，可以随时将新的减毒靶点引入疫苗候选株，并且根据需要可随时引入不同的突变对减毒株的减毒程度进行调节。美国NIH、NIAID下属的传染病实验室利用反向遗传学技术构建了4个型登革病毒减毒嵌合活疫苗。Lai等在利用感染性转克隆技术构建减毒活疫苗方面的工作最为引人注目，1991年他们将DEN-4814669株构建成第一个登革病毒感染性的全长cDNA克隆；Whitehead等对其进行了进一步优化，获得了操作简便、稳定性更好的DENV4反向遗传学系统，随后又利用同一改构优化的pBR322载体分别构建了DENV1、DENV2和DENV3反向遗传学系统，完成了疫苗研究平台的构建。进一步可利用由缺失DENV3′端非编码区30个碱基（Δ30）的cDNA得到的减毒株和型间嵌合技术构建登革病毒四价疫苗，配伍方式有3种，即TV1(rDENV1Δ30、rDENV2Δ30、rDENV3Δ30、rDENV4Δ30）、TV2(rDENV1Δ30、rDENV2/4Δ30、rDENV3/4Δ30、rDENV4Δ30）和TV3(rDENV1Δ30、rDENV2/4Δ30、rDENV4Δ30和10倍剂量的rDENV3/4Δ30）。猴动物实验表明，TV1和TV3免疫28d后，诱导的中和抗体滴度分别达到1∶52～1∶273和159～1∶144;TV2诱导DENV2和DENV3中和抗体滴度较低，但4个月后二次加强免疫，中和抗体滴度均大于1∶100；两剂TV2和TV3加强免疫策略可诱导针对所有4个型DENV的全面的免疫保护，说明TV2和TV3是应用前景较好的候选疫苗配伍方式。随后的临床实验表明，DENV1Δ30、DEN2/4Δ30和DENV4Δ30疫苗候选株安全有效、减毒表型明确，病毒滴度最高可达10-2～10-3pfu/mL，在短期病毒血症期间，有50%的志愿者出现一过性皮疹，7%～40%出现白细胞减少症，少数受试者丙氨酸转移酶（ALT）一过性升高；尽管伴随一些不良反应，但对人体是安全的，可诱导全面的免疫保护。DEN3/4Δ30的临床实验正在进行，各单价疫苗亦在进一步优化过程中。美国Acambis公司利用ChimeriVax技术平台，研制了一种以YF17D为骨架的四价嵌合型DENV疫苗，用4个型DENV的PrM-E蛋白替代YF17D骨架中的相应部分，分别构建4个型DENV嵌合减毒疫苗候选株。其减毒的机理推测是源于YF17D骨架中的适应性突变和嵌合作用本身，因为大量实验数据表明嵌合体较其母本的复制水平低。但具体的减毒表型尚未进行正式鉴定。单价疫苗动物实验表明，病毒在蚊体内复制受限；猴实验表明，每个型103～104.5pfu可诱导高水平的中和抗体，可有效抵抗野生型登革病毒的攻击。四价配伍后单剂人体Ⅰ期临床实验显示该嵌合四价疫苗是安全的，而且没有不良反应发生，显示出良好的应用前景。美国疾病预防控制中心与AventisPasteur公司以泰国Mahidol大学开发的DENV2-PDK-53减毒株为骨架，用类似于ChimeriVax技术的嵌合策略构建其他3个型别的疫苗候选株。DENV2-PDK-53减毒表型已经鉴定，是由存在于结构蛋白基因区之外的3个减毒突变产生的。单价疫苗鼠动物实验显示具有免疫反应性和保护作用，四价疫苗猴动物实验最近已经完成，临床前期实验正在进行，预计将进入人体Ⅰ期临床实验。2denv2s142003在vee-roi/细胞培养中的作用鉴于全病毒灭活疫苗在流行地区需要加强接种，并且DENV在批准的哺乳动物细胞中复制滴度很低，迄今研制灭活的四价DENV疫苗并不被看好。但WRAIR的Putnak等使DENV2S16803株在Vero细胞培养中的产量增加到109pfu/细胞，小鼠和猴经这种纯化的灭活疫苗免疫后，产生了高滴度中和抗体，并能抵抗野生型病毒的攻击。其简要制备过程如下：病毒首先在Vero细胞中增殖，经超速离心和蔗糖密度梯度纯化后，高滴度的纯化病毒（109pfu/mL）经福尔马林灭活，与明矾和其他佐剂一起免疫猴可诱导高水平中和抗体产生。在这项探索性研究之后，可能会出现类似的其他血清型DENV灭活疫苗。3人体实验阶段亚单位疫苗首选的抗原靶标是E蛋白，已经有多个表达系统可以制备表达E蛋白的疫苗候选株，而且这些亚单位疫苗免疫小鼠后可诱导中高水平的抗体表达。尽管其有较高的安全性，但也同样具有灭活疫苗的部分或全部缺点。到目前为止，尚无一个登革亚单位疫苗进入人体实验阶段。最近Guzman等完成了用截短的DENV2和DENV4的E蛋白制备的亚单位疫苗免疫恒河猴的动物实验。结果表明，以明矾为佐剂，100μg剂量的疫苗经4次加强免疫，只能对野生型DENV2攻击提供部分保护。Simmons等与HawaiiBiotech公司合作，利用果蝇细胞表达的DENV2E蛋白，采用5种佐剂2剂加强的免疫程序，尽管初免后中和抗体水平差异较大，但最高剂量组与2种佐剂加强免疫后的猴动物实验表明获得了全面的保护。HawaiiBiotech公司正利用该策略对其他型别的E蛋白进行亲和纯化，不久4个型登革疫苗候选株将进入Ⅰ期和Ⅱ期临床实验。4蛋白高通量疫苗的复配虽然有很多重组病毒载体系统被用于表达DENV抗原，但以重组痘病毒和腺病毒为载体所构建的疫苗候选株未能获得成功，开发新的载体技术平台是十分必要的。DNA疫苗与重组病毒载体疫苗一样可以通过将登革病毒PrM-E等抗原通过构建好的质粒导入相应的宿主细胞而使其递送的登革抗原得到表达，并且可以包装成假病毒颗粒形式表达。针对DENV1PrM-E的DNA疫苗猴动物实验表明，3剂加强免疫策略可有效抵抗野生型病毒攻击。对疫苗进行改进优化后现已进入临床实验阶段。DNA疫苗较之传统疫苗具有许多优势，如抗原性强、保护时间长、容易改造、制备和储存方便等。但是，DNA疫苗导入细胞和机体的效率和表达水平低，需要多剂免疫策略，并需要优化佐剂和特殊的递送设备，这无疑会增加疫苗成本。利用重组病毒载体和DNA疫苗载体表达DENVE蛋白的二次加强免疫策略正在进行中，但对于在流行区推广低成本的登革四价疫苗，这两种方法过于复杂，其开发前景有待进一步考证。5主要问题5.1侵权双网融合模型的应用在进行人体试验前，缺乏预先评价病毒对人体减毒及免疫效果的动物模型。无论是最早使用的乳鼠模型，还是后来研发应用的免疫缺陷小鼠模型和高等灵长类动物模型，除了可产生病毒血症外，并不会产生与人类感染DENV类似的疾病状态，所以现有的上述动物模型均无法复制模仿在人感染病毒时的病理生理改变，给疫苗候选株的筛选和评价带来很大困难。5.2血清学调查的必要性这种现象产生的机制尚不清楚，尤其当受试者处于登革病毒不同阶段的免疫状态时，发生干扰现象的几率可能会增加，提示确定目标人群和对目标人群进行准确的血清学调查是必要的。5.3减毒程度不适当，减毒能力不足临床实验结果表明，在表1所列的四价减毒活疫苗中，除了美国Acambis公司利用YF17D为骨架的四价嵌合登革疫苗外，其他几个候选株均伴有轻微不良反应。这提示减毒程度并不适当，或者减毒不够，或者过度减毒，个别疫苗候选株须进一步优化。此外，利用DENV型间嵌合技术构建的减毒株较之利用YF17D为骨架构建的属间嵌合减毒株，除了可诱导相似的免疫保护作用外，后者的不良反应发生率明显要低，这是否预示除了PrM-E外，在DENV减毒骨架中还存在与病毒致病机制密切相关的其他重要因素。5.4