登革热的诊断与治疗

登革热的诊断与治疗

绿色植物是由登甲病毒（daguevius，dv）引起的一套害虫传播性传染病。传播媒体主要是埃及寄生虫。感染DV后可发生登革热(Denguefever,DF)、登革出血热(Denguehemorrhagicfever,DHF)、登革休克综合征(Dengueshocksyndrome,DSS)。DV有4种血清型,即DVⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。DV引起的感染广泛流行于全球热带和亚热带地区,特别是东南亚、西太平洋、中南美洲、非洲,发病率和病死率均较高,是最为严重的一种虫媒病毒性疾病。全球有100多个国家有该病发生,每年约5000万人感染,50万人需入院治疗,病死率高达5%。DV感染机体后可呈现两种不同的状态,即原发感染状态和继发感染状态。在第二次感染异型DV的患者中容易发生DHF和DSS,且病死率较高,其发病机制是依赖抗体增强的感染作用。区分这两种状态对于临床治疗非常重要。采集急性期和恢复期双份血清进行IgM和IgG抗体测定是鉴别这两种感染状态的新标准。DV感染的实验室诊断,主要有病毒分离、抗体和抗原检测、基因诊断等。WHO曾经把血凝抑制试验(HI)作为登革热的标准诊断方法。然而,病毒分离所需时间较长,达不到快速诊断的目的,而常规的血清学诊断又因存在广泛的交叉反应而受到干扰。近年来,随着DV基因组序列分析成功及核酸杂交和聚合酶链反应(PCR)技术的建立,对DV感染的诊断已进入到分子生物学检测的新阶段。1蚊病毒分离采集急性期病人的血清,死亡患者的组织块(肝、脾、脑、血块等)或埃及伊蚊的标本胸内接种白纹伊蚊,1周以后,分离病毒。此外,亦可接种乳鼠或细胞分离病毒,但均不及蚊虫分离敏感。病毒分离是登革热的确诊依据。但病毒血症存在的时间较短,与机体发热持续时间一致,约2~7d,只有发病早期的血液样本分离DV才有较高的检出率。因至少需要1周时间才能出结果,达不到早期诊断的目的。2传统血液清学的诊断方法常规血清学诊断为经典方法,有血凝(HA)与血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CF)和中和试验(NT)。2.1抗体反应情况DV具有血凝活性,在适宜的pH条件下可凝集红细胞,此凝集能被相应的抗血清抑制。利用这一反应,可对抗原抗体进行鉴定。HI测定分原发抗体反应和继发抗体反应两种。原发抗体反应在第4病日前的血清抗体效价一般低于1∶20,恢复期(发病后1~4周)效价增长4倍以上,但不超过1∶1280。继发抗体反应在第5病日前抗体效价低于1∶20,而恢复期达1∶2560以上。由于与其他虫媒病毒B组成员的感染有交叉反应,HI试验逐渐被IgM、IgG抗体测定法取代。2.2补体结合试验cf这是一种老方法,该方法复杂、费时,敏感性和特异性较差,现已少用。2.3病毒的鉴定和诊断感染DV数日后,血清可出现保护性抗体即中和抗体。作用于DV后,使其不能在细胞内复制或繁殖,失去感染能力。用此试验可进行病毒的鉴定和特异诊断。NT特异性强,但操作繁琐,不同血清型DV间也有交叉反应,通常不用作诊断。3间接elisa试验、igm抗体反应、pcr检测快速诊断包括间接免疫荧光(IFA)、间接ELISA试验、IgM抗体捕获、核酸杂交、聚合酶链反应(PCR)等方法,敏感、特异、快速,适于大量标本的检测。3.1荧光显微镜下显明法固定于载体上的抗原与检样中的抗体结合,形成抗原-抗体复合物,然后用荧光素标记的二抗与其结合,荧光显微镜下显出特异荧光。该方法可查抗体,也可查抗原。在敏感性方面略优于HI,最早能在发病后3d检出IgG类抗体,完全可以替代HI进行DF的早期诊断。但各型DV之间有高度的交叉反应。3.2酶标记二抗之复合膜的制备血清中的抗体可与固相载体表面的抗原结合形成抗原—抗体复合物,再加入酶标记的二抗与其结合,当加入酶底物后产生呈色反应,可用目测或分光光度计定性和定量。无论IgG、IgM抗体检出都有诊断价值。3.3dv抑制剂的检测先用抗人IgM抗体包被固相,以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对DV抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM),然后加入DV抗原,此抗原仅与DV特异性IgM类抗体相结合,继而加酶标记抗DV特异性抗体,再与酶底物作用。显色强度与标本中特异性IgM类抗体水平成正相关。此法准确特异、敏感、稳定,对实验设备要求不高,而且已经有成熟的试剂盒可供使用。但由于临床症状刚出现的1~3d内常有病毒血症,IgM类抗体可能尚未产生,此时IgM类抗体检出率较低。例如,PCR确诊的原发性和继发性登革热早期(1~3d)病人,本法检出率均低于10%,而在病后4~7d,分别达55%和47%,7d后高达94%和78%。由此可见,本法在登革热的早期诊断中还是有相当价值的。3.4dv抗体检测待测血清中的抗体可与吸附于硝酸纤维素膜上的DV抗原结合,再加入酶标记的二抗和酶的作用底物后,即可呈现斑点状着色。此法可检测待测血清中的特异性IgG抗体,阳性结果可作为DV感染的参考。早期血清阴性,恢复期血清阳性可确诊DV感染。本法在1991年创立,1∶1000血清中能检测出DV抗体,特异性高达97%,检出抗体的最高滴度为1∶16000。1992年此法被介绍到国内,临床疑似病人和恢复期患者有49.8%和93.5%阳性,抗体最早检出时间为病后5d,5d内检出的阳性人数占总阳性人数的95.1%。2002年徐建敏等比较了DF-IgG斑点法、胶体金免疫层析法和DF-IgM斑点法检测登革热抗体的敏感性、特异性及其他优缺点。结果表明,DF-IgG斑点法敏感性较高,具有排除干扰因素影响的优点,适于登革热散发病例使用;胶体金免疫层析法有快速敏感的优点,适于在登革热暴发流行期间作初筛试验;DF-IgM斑点法特异性较强,可用作确证实验。3.5胶体金免疫层析检测1997年姚海军等建立斑点免疫金渗滤法,血清中抗DV的特异性抗体与点样在硝酸纤维素膜上的DV抗原反应,再滴加胶体金标记的二抗时在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集,形成肉眼可见的红色斑点。当在硝酸纤维素膜下垫有吸水性强的垫料时,反应速度加快,在数分钟内即可显出颜色。该法可用来检测IgM类和IgG类抗体,敏感性可达96.6%。目前已经开发出胶体金免疫层析快速检查登革热IgM和IgG抗体的测试卡(简称登革热快速测试卡),可以判别DV的初次感染和二次感染。赵珠英等用此卡和HI分别检测血清IgM、IgG抗体,发现前者登革热IgM抗体检出率显著低于HI,但两者IgG抗体检出率无显著性差异。于永民等人用该测试卡检测35份已确诊的DF急性患者血清,97.1%的样本IgM抗体阳性,IFA阳性率91.3%。用该测试卡检测32份确诊的DF恢复期患者血清,IgM抗体100%阳性,IFA法29份(90.6%)IgM抗体阳性。由此可见,胶体金免疫层析法较为简便可靠。3.6分子杂交成像探针是检测特异性互补序列的有效工具,而制备标记的特异性探针是完成杂交的先决条件。由于同位素探针存在着放射性污染,有半衰期短、显影时间长等弊端,分子杂交朝着非同位素标记探针的方向发展。运用核酸杂交法检测DV的RNA具有特异性强、敏感性高的优点,可作为RT-PCR诊断后的确认手段。但核酸杂交法依赖于病毒的分离培养,从标本采集到出结果一般需3d,所以仅具有限的早期诊断意义。且费用较昂贵、技术要求高、操作过程复杂,存在费时费力等问题,不宜临床实验室常规采用。3.7dv基因rt-pcr检测d内可出结果,所用血清量少、方法简便,可快速分型,为登革热的临床和流行病学诊断提供了一种有效手段。用一对通用引物扩增,可以同时检测DV的4个型,然后应用内引物或者核酸杂交和酶切分析来进一步鉴定。有的学者合成了型特异的引物,每一对引物检测一个型别。方美玉等用套式PCR法分型检测DV基因,先用通用型引物扩增,然后用套式PCR方法分型鉴定,共检测DF患者血清21份,发现DEN1型阳性18份,DEN2型阳性2份。文建华等用RT-PCR检测广东省1995年55份疑似DF患者急性期血清标本中DV的RNA,并与病毒分离法相比较,结果病毒分离阳性率为49.1%,RT-PCR的检出率为38.2%,敏感性为77.8%,