大鼠三叉神经本体觉中枢通路中vglu1样阳性终末的分布

大鼠三叉神经本体觉中枢通路中vglu1样阳性终末的分布

该研究团队过去曾多次研究三叉神经主体感觉丧失的中枢神经通道，并对三叉神经中脑核（me）和丘脑后纵切核（vpm）之间的行为进行了验证。其中组成“四级通路”的核团依次为Vme、三叉神经脊束核吻侧亚核背内侧部及其邻接的外侧网状结构(Vodm-LRF)、“带状区”和丘脑VPM。其中“带状区”由三叉神经感觉主核的背内侧部(dorsomedialpartoftheprincipalsensorytrigeminalnucleus,Vpdm)、三叉上核的尾外侧部(caudolateralpartofthesupratrigeminalnucleus,Vsup-CL)、三叉神经运动核腹侧区(theareaventraltomotortrigeminalnucleus,AVM)和上橄榄核背侧区(theareadorsaltothesuperioroliverynucleus,ADO)四个核团组成。众所周知,谷氨酸(glutamate,Glu)在口面部本体感觉信息向中枢上位脑结构的逐级传递中起着十分重要的作用。最近已经克隆出三种囊泡膜谷氨酸转运体(vesicularglutamatetransporter,VGluTs),分别被命名为I、II和III型囊泡膜谷氨酸转运体(VGluT1,VGluT2和VGluT3)。已有大量研究表明,VGluT1和VGluT2广泛地分布于以Glu为神经递质的脑区,如丘脑、延髓和脊髓;超微结构研究也进一步观察到,它们几乎分布于非对称性突触的突触前终末内,并被装配在突触小泡膜上,故目前人们已将VGluT1和VGluT2广泛用作谷氨酸能神经终末的标识物。最近有一些资料也显示,在大鼠脑干和脊髓内传递触压觉和本体觉信息的初级传入纤维主要表达VGluT1,而传递伤害性信息的初级传入纤维主要表达VGluT2;且VGluT1在Vme神经元胞体内的表达在生后发育期存在着消长变化。以上研究均提示,VGluT1可能与来自口面部和躯体本体觉信息的传递密切相关。但是,目前有关VGluT1样阳性终末在三叉神经本体觉中枢传导通路中的第三级核团内的表达及其终末来源等问题,尚未见报道。因此,本实验综合运用免疫组织化学、逆行束路追踪和免疫荧光组织化学双标技术,对VGluT1样阳性终末在大鼠脑干“带状区”内的分布和来源、以及与向丘脑VPM投射神经元之间的联系进行了研究,旨在为进一步阐明谷氨酸在三叉神经本体觉传导通路中的作用提供可靠的形态学依据。材料和方法1.回复突变体ate雄性SD大鼠3只,体重250～280g,戊巴比妥钠(80mg/kg)腹膜腔注射麻醉后,插管至升主动脉,先以100ml0.025mol/L的磷酸盐缓冲液(phophate-buffersaline,PBS,pH7.3)冲洗血液,再用500ml含4%多聚甲醛的0.1mol/L的磷酸缓冲液(phophatebuffer,PB,pH7.3)灌注固定,持续30min以上。灌毕立即取脑,并移入含30%蔗糖的0.1mol/L的PB中,至其沉底(4℃)。冰冻切片机行脑干冠状切片,片厚30μm,分为2套收集。第1套切片用于VGluT1的免疫组织化学染色。具体步骤如下:(1)兔抗VGluT1IgG(0.3μg/ml,日本京都大学金子武嗣先生惠赠)室温下孵育过夜;(2)生物素结合的驴抗兔IgG(10μg/ml,Jackson)室温下孵育4h;(3)ABC-Elite(1∶100,Vector)孵育切片3h。其中步骤(1)和(2)用含5%驴血清、0.05%叠氮钠、0.5%TritonX-100和0.25%角叉菜胶的0.05mol/L的PBS稀释,步骤(3)用含0.5%TritonX-100的0.05mol/L的PBS稀释。上述反应完成后的切片进行DAB和H2O2呈色。所有切片进行脱水透明、DPX封片后光镜下观察并拍照。第2套切片用于对照实验。用正常血清替代一抗血清进行免疫组织化学染色,结果为阴性。2.术后动物分组和处理雄性SD大鼠6只,体重250～280g,戊巴比妥钠(40mg/kg)腹膜腔注射麻醉后,开颅,根据Paxinos和Watson大鼠脑图谱,将0.2μl含10%的四甲基罗达明(tetramethylrhodamine-dextranamine,TMR-DA,MolecularProbes)用尖端粘接微玻管的微量注射器缓慢经压力注入一侧丘脑VPM,注毕原位留针15min,以防止标记物沿针道扩散。术后动物存活7d后,如前文行麻醉、灌注固定、浸糖和切片,切片分3套收集。第1套切片直接裱在玻片上,用于检查TMR注射区和TMR逆标神经元在“带状区”内的分布情况。第2套切片用于VGluT1免疫荧光组织化学染色。具体步骤如下∶(1)兔抗VGluT1IgG(0.5μg/ml,日本京都大学金子武嗣先生惠赠)室温下孵育过夜;(2)生物素结合的驴抗兔IgG(10μg/ml,Jackson)室温下孵育4h;(3)Alexa488标记的Avidin-D(10μg/ml,MolecularProbes)中室温下孵育6h。抗体孵育液如前所述。第3套切片用于对照实验。用正常血清替代一抗血清进行免疫荧光组织化学染色,结果为阴性。上述所有切片均在荧光显微镜(BX60,Olympus,Japan)下观察(TMR的激发光波长540～552nm;发射光波长≥575nm;Alexa488的激发光波长450～490nm,发射光波长515～565nm)。用CCD摄像系统采集图像。选择较好的切片,进一步在激光共聚焦显微镜(FV1000,Olympus,Japan)下观察TMR逆标神经元与VGluT1样阳性终末之间的关系(TMR的激发光波长590nm;发射光波长615nm;FITC的激发光波长490nm,发射光波长520nm)。以上所摄取的图片均用Photoshop7.0软件调整对比度,以达到理想效果。3.感根和运动根的分离6只雄性SD大鼠(240～280g),在戊巴比妥钠(40mg/kg)腹膜腔注射麻醉后,经颅中窝暴露单侧的半月节及三叉神经后根,并分离出感觉根和运动根,其中3只大鼠切断感觉根,另3只大鼠切断运动根。术后,前者存活7d,后者存活8周,然后如前文行麻醉、灌注固定、浸糖、切片以及进行VGluT1免疫组织化学染色。结果1.小不一硅系的阳性轴突终末分布在VGluT1免疫组织化学染色切片上,光镜下可观察到大量的VGluT1样阳性轴突终末呈大小不一的棕色点状,广泛分布于“带状区”的四个核团内(Fig.1A)。特别是在Vsup和Vpdm内,VGluT1样阳性轴突终末呈密集分布;而在三叉神经运动核腹侧和上橄榄核背侧的两个较小核团(AVM和ADO)所在的区域内,也可见密集的VGluT1样阳性终末(Fig.1A)。2.逆标神经元的细胞体将逆行追踪剂TMR注入丘脑VPM后,在“带状区”的四个核团(即Vsup、Vpdm、AVM和ADO)内均可观察到TMR逆标神经元的胞体(Fig.1B-D),其逆标神经元的分布模式与以往的报道完全一致。在进行VGluT1免疫荧光组织化学染色的切片上,可见大量的VGluT1样阳性终末广泛分布于TMR逆标神经元所在的区域内;进一步在激光共聚焦显微镜下可观察到部分VGluT1样阳性终末包绕在TMR逆标神经元的胞体或树突周围,并与之形成密切接触(Fig.1C-D,1C’-D’)。3.不同核团内vglut1的变化当切断三叉神经感觉根或切断三叉神经运动根后,在“带状区”内均可观察到VGluT1样阳性终末的表达发生了明显变化,但这种变化在不同核团内有所不同。当切断单侧三叉神经感觉根7d后,可观察到手术侧Vpdm内的VGluT1样阳性产物明显有所下降,但其它三个核团未观察到明显变化(Fig.2A);而当切断单侧三叉神经运动根8周后,在手术侧Vsup内可观察到VGluT1样阳性产物几乎完全消失,但Vpdm、AVM和ADO内未发生明显变化(Fig.2B)。vme神经元的中心分布VGluT1是一种囊泡膜谷氨酸转运体,广泛地分布于中枢神经系统谷氨酸能神经终末内。Landry等的研究表明,脊髓背角传递机械性感受或本体感觉的初级传入终末均表达VGluT1样免疫阳性。Todd等用跨节追踪剂霍乱毒素B亚单位(choleratoxinbsubunit,CTb)标记大鼠后肢有髓纤维后,观察到脊髓背角内被标记的有髓纤维终末均呈VGluT1样免疫阳性。Wu等和我们课题组最近的研究也报道,传递后肢和口面部本体觉信息的外周感受器,如股三头肌和咬肌肌梭内均可观察到较强的VGluT1样阳性末梢呈螺旋形环绕在梭内肌纤维的中央区。本实验在三叉神经本体觉中枢通路的三级核团,即“带状区”的四个核团内也观察到大量的VGluT1样阳性终末呈串珠状分布,其结果与以往报道一致。众所周知,三叉神经运动根由三叉神经运动核(motortrigeminalnucleus,Vmo)和Vme发出的纤维合并而成,其中Vme神经元的周围突主要分布于上、下颌牙齿及牙周膜的机械感受器和闭口肌的肌梭,传递口面部的本体觉信息;而传递口面部触压觉信息的初级神经元的胞体主要位于三叉神经节(trigeminalganglion,TG),其中枢突在脑干内有一个较为广泛的投射区,其中包括Vsup-CL和Vpdm。本实验在切断三叉神经感觉根7d后,即去除三叉神经节细胞的投射后,手术侧“带状区”内可观察到Vpdm内的VGluT1样阳性物质的表达比正常侧明显有所下降,但其他核团无变化;而切断三叉神经运动根8周后,手术侧“带状区”内只观察到Vsup内的VGluT1样阳性产物几乎完全消失,但Vpdm、ADO和AVM内均未观察到任何变化。2006年我们课题组曾经报道,将CTb注入外周咬肌神经后,除了Vme神经元的胞体被标记外,在Vsup-CL和Vmo内也可观察到大量的CTb标记终末,且这些标记终末的绝大多数均表达VGluT1样免疫阳性。另外,切断一侧下颌神经后,手术侧与对照侧相比,术后存活1周组的Vpdm内VGluT1样阳性物质的表达有所下降。结合以往的研究,本实验所观察到的以上结果充分表明,“带状区”Vpdm内的VGluT1样阳性终末主要来源于TG细胞;位于Vsup-CL的那些VGluT1样阳性终末则主要来源于Vme神经元的中枢突,而ADO和AVM内的VGluT1样阳性终末既不来自于TG细胞,也不来自于Vme神经元,我们推测很有可能来自于中枢其他脑区,但此来源的具体部位则有待于今后进一步深入研究。以往的束路追踪研究已经表明,大鼠“带状区”为口面部本体感觉信息向丘脑VPM传递通路中的第三级中继核团,它接受Vodm-LRF的投射,然后再将本体觉信息传向丘脑VPM。本研究在激光共聚焦显微镜下在“带状区”的四个核团内均观察到部分VGluT1样阳性终末包绕在TMR逆标神经元的胞体或树突周围,并与之形成密切接触。显然,传递口面部本体觉信息的Vme神经元的轴突终末与传递口面部触压觉信息的TG细胞的轴突终末在Vsup-CL和Vpdm内进行了汇聚,然后又将汇聚整合后的信息传向丘脑VPM;而在将这些汇聚后的信息向丘脑传递的过程中,谷氨酸发挥着重要作用。综上