基因敲除小鼠滑膜细胞数量的影响因素

基因敲除小鼠滑膜细胞数量的影响因素

0外在联合培养小鼠flss的研究纤维样本滑膜细胞（fhss）是滑膜层的最大细胞，在维持关节的正常生理功能和内部环境的稳定方面发挥着重要作用。异常增生活化的FLSs在关节病变中起关键性作用,其已广泛应用于关节疾病发病机制的研究中。目前已建立了较为成熟的体外人、大鼠FLSs培养体系,主要有组织块培养法和酶消化法。近年来基因敲除小鼠越来越广泛地应用在关节疾病研究中,培养小鼠FLSs的方法现已有报道。然而影响体外培养原代小鼠FLSs数量和纯度的因素较多,如关节处理方法、消化酶种类、酶消化时间等。目前关于此类影响因素研究的报道较少。本研究在体外培养小鼠原代操作过程中,发现影响FLSs数量与纯度有3个主要因素:关节处理方式、消化酶种类及酶消化时间,并对其进行探讨,为获得高数量、高纯度FLSs提供参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1实验动物与饲料健康SPF级C57雄性小鼠,6月龄,12只,体重20~30g,由成都医学院动物中心提供,实验动物合格证号:0017184,在独立通风鼠笼IVC系统饲养,给予标准饲料和饮用水,用于分离培养FLSs。1.1.2主要设备超净工作台(苏州安泰);荧光倒置相差显微镜(Olympus);ue4d2流式细胞仪(BD公司)。1.1.3苏氏原酶胎牛血清(上海普飞),L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素(北京索莱宝),2-巯基乙醇(美国Sigma);Ⅳ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶(Gibco),流式抗体(BD)。1.2方法1.2.1皮肤、肌肉的分离将小鼠脱臼处死,置于75%乙醇中浸泡5min。随后在髋关节处小心取下小鼠双后肢,保证关节面完整。将取得的小鼠后肢置于75%乙醇培养皿中浸泡5s,用眼科剪纵行剪开皮肤至脚趾尖。用有齿镊、眼科剪分离皮肤、肌肉及筋腱;为避免骨髓细胞污染,操作过程不能出现骨断裂。将取得的组织用100U/mL青霉素、200μg/mL链霉素的PBS漂洗3次以减少污染。1.2.2型胶原酶的分离和培养随机数表法取6只小鼠,打开其关节处理:将去尽皮肤、肌肉的后肢置于无菌培养皿中,用手术刀依次打开趾关节、踝关节、膝关节,保证关节面完整;不打开关节处理6只小鼠:直接将小鼠后肢进行消化。消化过程为:将小鼠后肢置于离心管内,加入浓度为10mg/mLⅣ型胶原酶(预实验初步判定Ⅳ型胶原酶转Ⅱ型胶原酶效果好)和含10%FBS的DMEM培养基。在37℃,转速200r/min的摇床中孵育1h,弃上清。向离心管内加5mLⅣ型胶原酶和20mLDMEM完全培养基,在37℃200r/min摇床中孵育5h。取出离心管剧烈涡旋5s,收集上清液800g,离心5min。DMEM完全培养基重悬细胞转入24孔板内,置于5%CO2培养箱中培养。每隔1小时收集消化后的细胞悬液,连续收集7h(预实验结果表明:Ⅳ型胶原酶处理7h后已将滑膜组织完全消化)。培养24h后,消化检测7hFLSs活细胞总数。1.2.3细胞悬液的消化将不打开关节的后肢置于2根50mL离心管内,分别加入1mL浓度为10mg/mLⅡ型+4mLDMEM、Ⅳ型胶原酶+4mLDMEM完全培养基进行消化。每隔1小时收集消化后的细胞悬液,连续收集7h。培养24h后,消化检测每小时FLSs活细胞数。1.2.4细胞悬液的收集Ⅳ型胶原酶消化不打开关节的双后肢,每隔1小时收集消化后的细胞悬液,连续收集7h。培养24h后,消化检测每小时FLSs活细胞数。1.2.5小鼠cd11b、充填cd293的检测收集消化后的FLSs置于1.5mLEP管内,加100μLPBS重悬细胞。向管内加入0.5μLAPC-cy7标记抗鼠CD11b抗体、0.5μLFITC标记抗鼠CD90抗体,轻轻吹打混匀,4℃避光孵育25min,再加0.5μL荧光染料孵育5min,洗涤后,加100μLPBS混匀上机检测。1.3统计学处理方法采用SPSS14.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(ue0af±s)表示,2组均数比较采用t检验,以P≤0.05为差异有统计学意义。2结果2.1flss形态表现Ⅳ型胶原酶消化培养24h后,倒置显微镜下观察FLSs形态多为梭形、菱形;而巨噬样滑膜细胞(macrophagelikesynoviocyte,MLS)多触角形态极不规则。培养第4天,镜下观察FLSs呈放射状生长,明显可见长满触角的MLS。第2代FLSs体积逐渐增大,伸展更充分,仍可见MLS。第3代表现出典型形态,MLS数量明显减少。第4代FLSs形态上鉴定基本为成纤维样细胞,细胞核呈椭圆形位于细胞中央且状态良好,偶见单个MLS。见图1。将培养24h和第3代的FLSs消化制成细胞悬液,分别用抗鼠CD90.2、抗鼠CD11b流式抗体双染。MLS表达CD11b,FLSs和MLS表达CD90.2。结果显示:24h细胞悬液中抗鼠CD11b阴性细胞比例为86.5%、第3代细胞悬液中抗鼠CD11b阴性细胞比例为97.3%。见图2。2.2flss损失有报道采用打开关节处理方式培养小鼠FLSs,但该处理不仅操作复杂且会造成FLSs损失。本实验结果显示:单后肢打开关节消化7hFLSs总数为(19133±115)个,单后肢不打开关节消化7hFLSs细胞总数为(24933±503)个,两者差异有统计学意义(P<0.05)。2.3型胶原酶消化7hfluss,型胶原酶消化7hfluss细胞计数结果本文比较了2种胶原酶消化对FLSs数量的影响。结果显示:Ⅱ型胶原酶消化7hFLSs总数为(18100±400)个,Ⅳ型胶原酶消化7hFLSs细胞总数为(24900±500)个,差异有统计学意义(P<0.05)。2.4100Ⅳ型胶原酶消化单支后肢,连续收集消化1~7h细胞悬液,活FLSs数分别为(700±300)、(600±100)、(15200±900)、(5100±800)、(2700±300)、(900±200)、(300±100)个。结果显示,消化1、2h,FLSs的数量较少,消化3h的FLSs数量最多,之后数小时消化FLSs数量逐渐减少。见图3。3不同药物消化对原代flss的影响越来越多研究表明,FLSs在关节疾病发病进程中扮演至关重要的角色。被激活的FLSs一方面分泌基质金属蛋白酶,侵蚀软骨和骨组织,引起关节畸形;另一方面FLSs分泌趋化因子、炎性细胞因子,引起关节炎症。基因敲除小鼠能用于某特定基因功能的深入研究,为寻找新的治疗方法提供了基础,这使得越来越多的学者开始关注其在关节病变中的研究。而建立高效率、短周期体外培养小鼠FLSs方法直接影响到后续实验。因此进行培养条件优化,提高原代FLSs数量及纯度是很有意义的。有文献报道采用打开关节处理方式培养FLSs。本实验比较打开关节处理和不打开关节处理2种方法。结果显示:不打开关节处理获得FLSs数量显著高于打开关节处理。在操作过程中发现:手术刀依次打开各关节时,不可避免会造成FLSs损失,而不打开关节处理不仅减少实验者的操作步骤,也有效避免了骨髓细胞污染。本实验结果显示,Ⅳ型胶原酶消化获得FLSs数量显著高于Ⅱ型胶原酶消化的数量,分别收集Ⅳ型胶原酶消化7h细胞悬液培养24h后检测,1h几乎无FLSs;2h的数量开始增多;3h的数量达到最高;4~6h的FLSs数量逐次减少,7h的FLSs降到最低,因为消化1、2h关节腔尚未完全打开,悬液肉眼可见大量成絮状的筋腱和肌肉,影响FLSs贴壁和增殖,建议弃去。消化3h关节腔完全打开,FLSs数量最多,而7h的FLSs数量太少。因此我们收集2~6h的悬液进行培养。原代细胞纯度相对较低,我们根据MLS贴壁紧、消化时间长(MLS需消化8~10min,FLSs4~5min)且在体外不增殖的特性,逐代将其去除。第3、第4代FLSs纯度可达到95%以上,能满足后续实验需要。关于鉴定FLSs,有文献报道可采用PCR扩增其标志性细胞骨架蛋白波形蛋白基因,也可采用FLSs表面标记物标记后流式细胞仪