高效表达登革1型病毒ns1蛋白的多克隆抗体制备

高效表达登革1型病毒ns1蛋白的多克隆抗体制备

病毒登甲病毒是黄毒科黄毒科重要成员，可分为四种类型。感染人类后，可导致登甲热、出血热和登甲休克综合征等疾病。登革病毒基因组为单股正链RNA,长约11kb,由单一的开放读码框(ORF)依次编码三个结构蛋白(C、prM和E)和七个非结构蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。其中非结构蛋白NS1为高度保守的糖蛋白,由352个氨基酸残基构成,分子量约为48kD。目前的研究表明,NS1蛋白参与病毒基因组的复制,可对干扰素、细胞因子通路及补体系统进行调控,在病毒感染、复制及病理过程中发挥重要作用。本研究利用大肠埃希菌表达系统对登革1型病毒的NS1蛋白进行重组表达,获得了具有免疫原性的重组蛋白,制备了相应多克隆抗体,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。1材料和方法1.1细胞培养和克隆载体登革1型病毒GZ-57株和蚊C6/36细胞均由本室保存。大肠埃希菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司。克隆载体pGEM-Teasy购自Promega公司(美国)。原核表达载体pET-32a(+)为Merck公司产品(德国)。1.2胶纯化试验剂及酶细胞培养基RPMI1640及胎牛血清为Gibco公司(美国)产品。RNA纯化试剂盒、质粒快速纯化试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒均为Qiagen公司(德国)产品。SuperScriptTMⅢ反转录酶为Invitrogen公司(美国)产品。ExTaqDNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶及DNA分子量标准均为大连宝生物公司产品。弗氏完全佐剂和不完全佐剂为Sigma公司(美国)产品。His标签抗体及碱性磷酸酶标记羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.3dna引物的设计根据已经发表的登革1型病毒基因组全序列(GenBank登录号;FJ176779.1)设计可扩增全长NS1基因的引物:5′-CGCGGATCCGATTCAGGATGCGTAATTAA-3′;5′-ATTTGCGGCCGCTGCAGAG-ACCATTGATTTGA-3′,并引入BamHⅠ和NotⅠ识别位点(下划线),引物由上海英骏公司合成。1.4养基于28培养C6/36细胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基于28℃培养。待长至单层后,接种登革病毒,吸附1h后换用含2%胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养,4d后细胞病变达到高峰时,收集培养上清用于提取RNA。1.5阳性克隆的构建取RNA按如下条件进行反转录:65℃5min,冰浴1min,55℃1h,70℃15min。反应完毕用RNaseH消化后,进行PCR扩增,具体反应条件如下:94℃4min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,共35循环;72℃延伸7min。胶纯化回收特异的NS1扩增片段,与pGEM-Teasy载体连接后转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选、PCR及酶切鉴定阳性克隆,目的片段经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后亚克隆至同样双酶切的pET-32a(+)载体,通过PCR及酶切筛选阳性克隆。并由上海英骏公司对阳性克隆进行测序分析。将鉴定正确的阳性克隆转化大肠埃希菌BL21(DE3),获得的工程菌株称为BL21/pET-NS1。1.6目的蛋白溶液的制备扩大培养重组工程菌BL21/pET-NS1,使用0.1mmol/LIPTG于37℃诱导5h,收集菌体,用PBS缓冲液重悬菌体后进行超声波破碎至菌液为半透明状态。将超声破碎后的菌液离心,分别收集上清和沉淀进行SDS鉴定。采用蛋白浸提法从SDS胶中回收纯化目的蛋白。电泳结束后,将预染Marker和少许样品条带切下,进行染色和脱色。根据预染Marker和被染色样品中目的条带的位置,切下未被染色的目的蛋白带,研碎后加入3～5倍体积的蛋白浸提液[0.05mol/LTris-Cl(pH7.9),0.1mmol/LEDTA,0.15mol/LNaCl,0.1%SDS],置4℃过夜,期间振摇3～4次。次日将浸提物于12000r/min离心10min,上清即为目的蛋白溶液。将目的蛋白溶液置于2%NaHCO3煮沸激活后的透析袋中,置复性液[0.05mol/LTris-Cl(pH7.9),0.1mmol/LEDTA,0.2mol/LNaCl,0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽,1mmol/L还原型谷胱甘肽]中4℃过夜,期间换复性液2～3次。1.7家兔的tbt-his标签抗体tj表达产物经SDS电泳分离,半干转移仪将胶上蛋白转移至PVDF膜上。使用含5%脱脂奶粉的TBST4℃封闭过夜。以本室制备的兔抗登革病毒血清(1∶200)或His标签抗体(1∶2000)作为一抗,碱性磷酸酶标记的羊抗鼠及羊抗兔IgG(1∶1000)作为二抗进行孵育。最后用BCIP/NBT显色。1.8动物中心6周龄雌性BALB/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。将纯化复性的重组NS1蛋白透析至PBS中免疫小鼠,剂量为50μg/只,颈背部皮下多点注射,共免疫4次,间隔时间为2周。1.9间接免疫荧光检测第4次免疫后10d,断尾采血,5000rpm离心收集血清,56℃灭活后梯度稀释与制备的登革病毒抗原片进行间接免疫荧光检测,具体步骤参见文献。待荧光效价超过1∶1000,处死小鼠并取血,分离血清备用。2基因重组表达质粒及免疫小鼠血清n1的表达以提取的登革病毒RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增全长NS1基因,用BamHI/NotI双酶切获得NS1基因片段后定向插入pET-32a(+)载体中,重组质粒经PCR及酶切鉴定均与预期结果吻合(图1)。经测序证明序列与NS1基因序列一致,表明获得了NS1基因重组表达质粒pET-NS1。阳性克隆菌在0.1mmol/LIPTG37℃诱导5h后表达达到高峰。蛋白(含融合标签Trx)经SDS电泳测定相对分子量约为55kD,与预测分子量大小一致。超声裂解后进行SDS,结果发现重组蛋白主要以包涵体形式存在,使用BandScan软件分析重组蛋白占菌体总蛋白的50%以上。采用蛋白浸提法回收纯化后重组蛋白,SDS显示重组NS1蛋白的纯度在95%以上。Westernblotting检测结果显示免疫血清及标签抗体均可与重组蛋白反应,并于55kD处显出阳性条带(含融合标签Trx)。NS1蛋白免疫小鼠血清与登革1型病毒感染的C6/36细胞抗原片进行间接免疫荧光试验,结果显示所获得的NS1抗血清对病毒感染细胞起阳性反应,胞质内可见特异绿色荧光,效价可达1∶1000以上(图2)。结果成功制备了抗登革1型病毒NS1蛋白的多克隆抗体。3重组蛋白的诱导表达本研究中,笔者使用含硫氧化还原蛋白Trx融合标签的原核表达载体系统,对登革病毒NS1蛋白进行重组表达。结果表明重组NS1蛋白主要以包涵体的形式存在。降低诱导温度、改变IPTG浓度等方法也未对可溶性蛋白的产量产生显著影响。分析登革病毒NS1蛋白序列发现,其包含12个保守的半胱氨酸残基,这些残基间二硫键的形成方式可能会对重组蛋白的表达形式产生影响。同时NS1蛋白还存在2个N-糖基化位点,而原核表达系统无法对重组蛋白进行翻译后的糖基化修饰,从而使重组表达的NS1与天然NS1蛋白的结构产生差异,这可能也是前者形成包涵体的原因之一。最近,Das等对NS1蛋白进行密码子优化的重组表达,结果在大肠埃希菌中表达的重组NS1蛋白仍以包涵体的形式存在。登革病毒NS1蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生特异的抗体反应。研究发现,NS1抗体不仅能够对登革病毒感染的小鼠有保护作用,而且能够与血小板表面的蛋白二硫键异构酶结合,在