运动训练对脊髓损伤后运动功能的影响

运动训练对脊髓损伤后运动功能的影响

脊柱损伤（rci）以“高发病率、高致残率、低死亡率”为特征，给社会家庭带来严重压力。自Aguayo等证明中枢神经有一定的再生能力后,脊髓损伤的治疗思路由神经保护转向促进神经再生,即促进损伤神经元和支持细胞的存活或替换;通过轴突再生和重塑,形成新的神经回路,部分代偿丧失的神经功能。然而,神经生长是中枢神经再生环境中各种因素交互作用的结果,脊髓损伤后再生困难与缺乏合适的微环境有关。中枢神经元再生困难主要原因不是神经元本身,而是中枢神经系统微环境不适合轴突再生。神经再生环境的“允许”作用表现为内在再生能力超过再生抑制作用且有轴突生长的正确导向。已有研究发现,脊髓不完全损伤的大鼠脊髓内存在自发的神经回路重建。外周神经损伤后环境中大量轴突再生相关的基因表达上调;如无外周神经预损伤,则基因表达不上调。提示中枢神经在一定条件下可以再生,且这种再生条件具有可诱导性。近年来,康复训练已广泛用于改善患者残肢功能,但其对神经再生的作用报道较少。本研究对比观察自然状态下和运动训练后,脊髓损伤后大鼠在运动功能上的变化,以及在脊髓内脑源性神经营养因子(BDNF)、诱导轴突分化因子Slit2、星型胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达规律,以了解康复训练对损伤后脊髓微环境的影响,探讨其治疗脊髓损伤的可能机制。1材料和方法1.1兔抗大鼠脑源性神经生长因子和纯化抗体包括资金、培养基等的免疫健康雄性SD大鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,体重320~350g。饲养环境温度20~24℃,相对湿度50%,自由饮食,分笼喂养。兔抗大鼠脑源性神经生长因子亲和纯化抗体;兔抗大鼠Slit2亲和纯化抗体;兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白亲和纯化抗体(均购自武汉博士德生物工程有限公司)。兔二步法检测试剂盒(PV-6001)、小鼠二步法检测试剂盒、DAB显色液(均购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。1.2方法1.2.1分组和治疗方法健康雄性SD大鼠70只,随机分为10个实验组和4个对照组(每组5只)。实验组包括4个递增的训练时程:训练1周(4组共20只)、训练2周(3组共15只)、训练3周(2组共10只)、训练4周(5只)。1.2.2不完全性髓伤模型的建立5%水合氯醛0.7ml/100g腹腔注射,麻醉后暴露胸10棘突,用止血钳咬去棘突及椎弓板,暴露脊髓。采用改良Allen’s撞击法,用10g重锤,沿一固定的中空细玻璃管自4cm高处垂直落下,致伤能量为10g×4cm,造成不完全性脊髓损伤模型。以伤后出现鼠尾痉挛为造模成功的标志。术后1~3天每天予青霉素20万U/只肌肉注射,预防感染。在脊髓损伤后1周内进行膀胱按摩,促进排尿,每天2次。1.2.3大鼠被动进入活动患1.2次损伤后7天开始,用自制装置将实验组大鼠悬吊固定于活动平板上,平板启动后大鼠被动爬行活动患肢,每日2次,每次5min。每组于训练结束后第1、2、3、4周(即损伤后14、21、28、35天)分别取材5只。1.2.4下肢运动功能的评估造模前及造模后每周进行1次改良Tarlov评分和Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分。评分均为2人合评。1.2.5免疫组织化学检测4%多聚甲醛心脏灌注固定后取大鼠T12~L1节段脊髓,经固定、脱水、透明,石蜡包埋、切片。按试剂盒说明进行免疫组织化学二步法染色。1.2.6中央管周围视野每只大鼠取1张切片,每张切片取腹角、背角、及中央管周围3个视野。使用Image-ProPlus5.0软件进行图像分析,比较不同组大鼠脊髓内阳性神经元染色的平均积分光密度A值。1.3t检验和最小显著差法数据用均数±标准差表示,用SPSS16.0软件分析,两组均数比较用t检验,多组均数比较用最小显著差法(LSD法)。P<0.05为差异有显著性。2结果2.1两组talrov评分比较正常大鼠改良Tarlov评分为5分。损伤后第1天大鼠双侧后肢完全瘫痪,评分为0。损伤后7天为功能恢复上升期,此时开始运动训练,除训练1周组在损伤后14、21、28、35天Tarlov评分与对照组比较,P>0.05外,训练2~4周组各时间点的Tarlov评分与对照组相比,P值均<0.05(图1)。正常大鼠BBB评分为满分21分,损伤后第1天评分为0。训练2周、训练3周、训练4周组在训练结束时与对照组比较,BBB评分均显著升高(P<0.05)。在训练结束后继续观察,评分与对照组相比,仍有显著差异(P<0.05)(图2)。2.2免疫组化检测结果2.2.1运动训练组对髓内bca表达的影响自然状态下BDNF的表达在损伤后7~14天表现出较高水平,14~28天逐渐下降,35天表达又有增高(图3、4)。在损伤后相同时间点,运动训练组大鼠脊髓内BDNF的表达较对照组(损伤非运动组)均明显增加(P<0.01)。运动训练组在14天以后始终保持较高水平,训练停止后未见显著降低,在训练2周观察2周时,BDNF的表达到各组最高值(图3)。2.2.2同时间点的两组大鼠一般情况比较运动训练组大鼠脊髓内Slit2的表达与同时间点的对照组(非运动组)比较,也有明显增加(P<0.01),以训练4周组表达最为显著(图5、6)。2.2.3下降：下降总体由“而非‘”下降与其他因子不同,GFAP在损伤后的表达为先升高后下降的趋势。在对照组,损伤后14天GFAP表达达到最高,此后逐渐下降;而运动训练1周、2周组均表现出GFAP表达高峰延迟,在损伤后28天平均积分光密度A值达到(0.2029±0.0087),但与对照组高峰值(0.2011±0.0043)相比,P>0.05。训练3周、4周组因取样时间点少,未显示出趋势变化(图7)。3运动训练对髓内神经再生微的调控作用本研究中,以改良Tarlov评分法对SCI大鼠脊髓损伤程度作初步评估,以BBB评分从大鼠后肢关节活动的数目和范围、负重程度及前后肢协调性、前后爪和尾部活动情况等多方面全面客观反映大鼠后肢运动功能。以脊髓损伤后7天,运动功能开始自然恢复的上升期为起点进行规律运动训练,结果显示,训练2~4周后大鼠肢体运动功能均有显著改善作用。且在训练停止后,后肢运动功能评分有延迟恢复,提示恰当的训练能够有效改善大鼠运动功能。大鼠脊髓损伤后,大量神经元丢失,广泛轴突变性、伴随严重功能丧失。相关功能的恢复有赖于通过损伤点的轴突的再生以及建立功能性突触联系。BDNF属于神经生长因子家族,是促进神经再生的重要神经营养因子之一,对各种感觉神经元、胆碱能神经元、多巴胺神经元以及GABA能神经元的发育分化与生长再生有维持和促进作用,从多方面参与神经再生。它被神经末梢吸收,沿轴突逆行运输到胞体,能提高神经细胞轴突的再生能力,更好地提供神经生长的微环境。研究表明,BDNF在mRNA水平上调节了cAMP反应原件结合蛋白(CREB)和突触蛋白Ⅰ的作用,而它们各自通过调节基因转录和突触传递影响神经功能的发挥。而且BDNF能同时增加自身和其受体的mRNA水平,提示运动可能以正反馈的形式扩大了BDNF对突触可塑性的影响。已有研究发现,大鼠脊髓半切损伤后,损伤点的BDNF水平下降,但损伤后进行自动转轮运动能够抵消这种降低,甚至使损伤处的BDNF水平高于正常,而且这种升高与运动长度有很高相关性。本实验中,运动训练组大鼠脊髓内BDNF的表达较对照组(损伤非运动组)均明显增加,提示运动训练促进了脊髓内BDNF的表达。最近有研究发现,在脊髓损伤的大鼠,运动能使CREB和突触蛋白Ⅰ的表达水平正常化,而BDNF阻断剂削弱了这些与运动有关的作用。这些均提示运动训练可能通过增加BDNF的表达,发挥其对突触生长的调控作用来改善神经再生微环境。除增加神经生长因子的表达外,运动训练还可能通过促进神经导向因子的表达,发挥其对突触生长的调控作用来改善神经再生微环境。Slits是一组胶质细胞分泌的细胞外基质蛋白,通过与其受体Robos结合发挥作用,是近年来研究较多的神经生长导向因子。在神经发育过程中,Slits及其受体Robo等调节轴突导向和神经元迁移,对于决定发育中的中枢神经系统联合纤维能否越过腹侧中线,正确投射到靶位具有重要作用。此外,Slits还参与神经元生长和分枝形成,促进感觉神经纤维的分支和延伸。中枢神经系统损伤后也有Slits的表达,HaginoS等用原位杂交证实,在液氮冷冻损伤的脑组织损伤点周围有Slits的表达;肖卫东等发现,SCI后受损脊髓局部存在Slit2的再次分泌,且在SCI后早期,损伤部位灰质的胶质细胞内即可检测到Slit2蛋白的表达。刘源等的研究表明,脊髓半横断损伤后3天,损伤位点近端前角运动神经元中Slit2mRNA的表达明显增加。本研究中,不仅各实验组Slit2免疫组化平均积分光密度A值较相同时间点对照组明显升高,且随训练时程或观察时间延长,Slit2表达总体呈逐渐增高趋势。从康复训练后神经功能的恢复来看,作为引导轴突生长方向的重要因子Slit2可能参与了神经损伤后的再生修复过程,引导轴突建立特异的神经通路,从而完成功能重建。脊髓损伤后早期星形胶质细胞肥大、增生,是一种保护性反应。此时,在损伤点周围,BDNF免疫阳性的星形胶质细胞和小胶质细胞显著增生,可能分泌更多的神经营养因子。GFAP作为构成神经胶质细胞的主要蛋白,也是中枢神经系统损伤后胶质反应的主要标志物。杨平林等报道,GFAP表达在脊髓损伤后5~7天达到高峰,损伤点及邻近区域反应性星形胶质细胞肿胀、增生。3~8周星形胶质细胞恢复正常状态,胶质瘢痕形成。本研究中,对照组GFAP的表达在14天时达到最高(可能与取材部位在损伤点周围有关),损伤14天后GFAP表达逐渐下降,至损伤后35天最低。尽管损伤后早期星型胶质细胞能吞噬髓鞘碎片和退变的轴突,分泌神经营养引起,有利于神经再生。但损伤后期,伴随胶质细胞的反应性增生,其所分泌的蛋白多糖和髓磷脂成分抑制轴突的延伸;局部空洞形成,增生的星形胶质细胞构成的物理屏障,成为神经纤维再生的极大障碍;微环境的各种不利因素最终导致轴突再生的失败。在本实验中,各运动训练组GFAP的表达均显示出高峰延迟,提示运动训练使反应性星形胶质细胞增生程度减小,胶质瘢痕形成减少,能显著改善损伤后期神经纤维再生的微环境。而训练2周组GFAP表达与训练1周、训练3周组比较明显降低,可见选择恰当的训练时程能够使神经再生环境达到最佳。本实验表明,脊髓损伤后大鼠在不同运动时程训练后,随着轴突生长、神经功能的改