性脊髓伤的临床治疗

性脊髓伤的临床治疗

在过去的20年中，对髓内损伤的研究有了很大进步，这与蘑菇动物模型的研究和发展密切相关。在多数情况下,研究者会根据实验目的而采用特定的动物模型,脊髓全横断损伤模型常用于轴突再生和移植的实验,但是目前脊髓全横断损伤模型存在几个问题:难以全横断,局部损伤大,由血运障碍引起的继发病理变化复杂,以致施加于损伤区的各种治疗方法其效果分析困难,因此根据还原论的方法,我们自行设计了一种脊髓全横断损伤模型,重点在于保存脊髓血管,现报告如下。材料和方法1.动物和小组雄性SD大鼠23只,体重225g~250g,随机分成实验组18只,对照组5只,实验组又分成实验A组10只、实验B组8只。2.手术方法2.1显微手术方法大鼠用1%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉,俯卧位,切口以T8棘突为中心,切开皮肤,长约3cm,紧贴棘突骨面纵形分离椎旁肌,直达椎板表面,用小乳突牵开器向两侧牵开椎旁肌,显露出T7~T9的椎板和棘突。然后将大鼠固定在可用于脊髓的立体定向仪上,咬骨钳咬除T7~T9的棘突,在显微镜下用高速牙科钻沿上下椎间关节内侧纵向磨开T7~T9的椎板,用显微镊小心移除椎板,避免撕破血管。在显露的脊髓的中间位置横向剪开硬脊膜和蛛网膜,将刮胡刀片掰成极窄的锐角三角形状,用其锐利的尖端在显露出的脊髓背静脉和两侧脊髓背动脉之间分别横向切开软膜和脊髓实质,并于软膜下,尽可能横断脊髓,切口处以外的软膜要保持完整。然后将吸引器伸入切口内,于软膜下吸断未横断的脊髓组织,保留脊髓背静脉、两侧的脊髓背动脉和脊髓腹动脉。实验B组动物完成脊髓损伤后不缝合硬脊膜,即刻断头处死动物取材,于手术暴露的脊髓节段上下各延长一节段处横断脊髓,标本迅速置入4%多聚甲醛溶液固定。实验A组动物用11/0显微缝合线缝合硬脊膜和蛛网膜(Fig.1),缝合肌肉、皮肤。术后大鼠每日人工排尿2次。2.2两种刀片分离性方法大鼠去除T7~T9的椎板后,纵向剪开显露出的脊髓硬脊膜和蛛网膜,用刮胡刀片在显露的脊髓的中间位置横向切断脊髓,刀尖要触及椎管前壁和侧壁骨面,反复切割脊髓,缝合肌肉、皮肤。2.3立体定向仪观察使用生物素化的葡萄糖胺(biotinylateddextranamine,BDA)进行顺行标记。处死动物进行组织学分析前14d在脑部给予示踪剂,动物麻醉后固定于立体定向仪上。在两侧覆盖感觉运动皮层的颅骨上各钻三个1mm直径的孔,在此6个点用显微注射的方法导入10%的BDA溶液各0.7μl,深度为皮层下2μm。注射7d后再在脊髓给予示踪剂,动物麻醉后固定于立体定向仪上,打开脊髓损伤平面的上一个节段,显露出正常脊髓,选择距离背侧正中静脉左右各0.5mm的两点,用显微注射的方法导入10%的BDA溶液各0.5μl于损伤头侧脊髓内,深度为1mm。3.社会学观察3.1制作和切割实验A组和对照组动物观察6周,经灌注固定,取包括损伤区及上下各两个节段的脊髓组织,标本制成40μm厚的5套连续矢状冰冻切片。3.2h.e.染色用一套组织标本切片行苏木精-伊红染色。3.3免疫组织化学取实组A组和对照组一套相邻标本切片用于BDA(见追踪实验)的显色和神经丝(neurofilament,NF)的免疫组织化学双标记检测,另外一套相邻切片用于NF和胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)的免疫组织化学双标记检测。组织化学染色方法简述:切片入0.01%的磷酸盐缓冲液清洗,然后入0.3%的TritonX-10030min,0.01%的磷酸盐缓冲液清洗,分别加入NF和GFAP一抗孵育,室温过夜,0.01%的磷酸盐缓冲液清洗,分别加入结合了用异硫氰酸荧光素和德克萨斯红的荧光二抗及结合了德克萨斯红的卵白素,室温孵育2h,0.01%的磷酸盐缓冲液清洗,封片,荧光显微镜下观察结果。所有一抗及荧光二抗都购自Sigma公司。4.动物运动功能评分采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动功能评分方法,实验组和对照组动物每周评分一次,评定者不清楚动物分组情况,评分时间固定于晚间7点进行。5.统计处理采用SPSS10.0统计软件包中的t检验。结果1.运动功能评分实验组和对照组大鼠伤后都表现为后肢完全性瘫痪,对针刺无反应。伤后1周时,实验A组和对照组大鼠都已有后肢的自主运动出现,两组动物后肢运动功能的BBB评分无统计学差异。从第2周到第6周,对照组大鼠的后肢功能恢复明显快于实验组,在每个观察点的BBB评分统计学差异显著(表1)。实验A组中BBB分值最高的动物和对照组中BBB分值最低的动物在各个观察点的BBB分值很接近;但和对照组中BBB分值最高的动物在各个观察点的BBB分值相差较大,实验A组在第6周时BBB最高值是8分,而对照组在第6周时BBB最高值是20分。2.h.e.染色观察的结果2.1骨髓灰质的保留实验B组切片上可见脊髓组织在损伤处完全离断,损伤处形成空腔,脊髓断端较平整,空腔两侧的脊髓灰质和白质完整,在邻近损伤处的脊髓灰质有散在的片状出血点。在脊髓腹侧,软脊膜保持完整,跨过损伤区。有的切片上可见到保留的脊髓腹动脉和脊髓背静脉(Fig.2)。测量每个标本连续切片上空腔的宽度,取均数代表该标本的空腔的宽度,八个标本的空腔宽度分别为0.25mm、0.34mm、0.38mm、0.38mm、0.63mm、0.81mm、0.85mm、0.95mm,均数为0.57mm。2.2不同大小脊膜下髓间组织形态的变化实验A组切片上见脊髓组织在损伤处直径略微变细,损伤处软脊膜完整,组织结构杂乱,呈网状,其中含少量小的空腔,但多位于软脊膜下,组织中可见软脊膜细胞,也可见少量吞噬细胞。在对照组BBB评分最低的大鼠脊髓切片上,脊髓损伤处软脊膜断裂,组织排列方向垂直于脊髓纵轴,并在背侧明显突出,远高于脊髓表面,大多为脊膜细胞。在对照组BBB评分最高的大鼠脊髓切片上,损伤处腹侧可见软脊膜完整,有约0.2mm厚的正常的白质结构,背侧软脊膜断裂,损伤区内多是脊膜细胞,呈纤维网格样组织结构。3.损伤区nf免疫反应纤维排列在实验A组正常脊髓和损伤区都出现NF免疫反应,但在正常脊髓中NF免疫反应纤维沿脊髓纵轴方向平行排列,而损伤区的NF免疫反应纤维虽然成束排列,但各束方向杂乱。对照组BBB评分最低的大鼠组织切片上也是正常脊髓和损伤区都出现NF免疫反应,但在损伤区的NF免疫反应纤维排列方向垂直于脊髓纵轴,且正常脊髓和损伤处的移行区仅有很少量NF免疫反应纤维;在对照组BBB评分最高的大鼠组织切片上同样正常脊髓和损伤区都出现NF免疫反应,但损伤区腹侧NF免疫反应纤维沿脊髓纵轴方向平行排列,背侧则呈无序排列(Fig.3A,C,E)。在实验A组及对照组BBB评分最低的大鼠组织切片上GFAP免疫反应出现在正常的脊髓组织中,且边缘多于中间,在损伤处无GFAP免疫反应组织;而在对照组BBB评分最高的大鼠的组织切片上,GFAP免疫反应出现在正常脊髓组织和损伤处腹侧部分,损伤处背侧部分则无GFAP免疫反应(Fig.3B,D,F)。4.运行结果及分析在实验A组中,BDA追踪显示再生的轴突最远延伸至损伤区,但未长入损伤尾端脊髓组织。在对照组BBB评分最低的大鼠组织切片上,BDA追踪显示没有BDA标记的轴突达到损伤区头端;而在对照组BBB评分最高的大鼠组织切片上,BDA追踪显示有较多BDA标记的轴突通过损伤处腹侧残存纤维部分,进入远端脊髓组织,并继续延伸几个节段(Fig.4)。髓腹侧组织残留到目前为止,对于脊髓损伤的研究还是主要集中在轴突再生,而使用全横断模型可以毫不含糊地证明再生的轴突和确定最有效的治疗策略,因此全横断模型是脊髓损伤研究中较常使用的动物模型。根据不同的研究目的,现在常用的全横断模型有重物下坠致伤模型,锐器切割伤模型等,但往往有如下缺点:(1)不能保证每次都能全横断脊髓,有时造成脊髓组织残留;(2)损伤区脊髓血供中断,横断水平以下脊髓静脉回流受阻,脊髓局部水肿、出血、血管痉挛和微血管栓塞严重,加重继发性损伤;(3)有的是开放性伤口,周围组织细胞易侵入脊髓两断端间的间隙,形成致密瘢痕组织,不利轴突再生。我们自行设计的还原论式全横断模型最大限度的克服了以上缺点。首先对于组织残留问题,有文献报告认为少于5%的腹侧或外侧脊髓白质组织残留,大鼠的运动功能就可以完全恢复,我们实验中对照组采用刮胡刀片切断脊髓,结果BBB后肢功能评分从术后第2周开始就明显高于实验A组,到第6周时有的最高分达20分(完全正常为21分),后肢功能几乎完全回复,H.E.染色、GFAP、NF免疫组织化学和BDA追踪检测证实脊髓腹侧组织残留,和该报告结果一致。而我们实验组采用自行设计的全横断模型,是在显微镜直视状态下,于软脊膜内小心细致地切断、吸除脊髓组织,可直观判定组织是否残留,根据我们的经验,脊髓组织吸除后,外侧及腹侧软脊膜可以完整保留,透明的软脊膜,可帮助判断组织是否残留,实验B组H.E.染色结果和实验A组GFAP免疫组织化学染色和BDA追踪结果也都证实脊髓组织在损伤区完全离断。对照组BBB后肢功能评分六周时最低的为8分,该大鼠的组织切片H.E染色、GFAP免疫组织化学染色和BDA追踪结果显示脊髓全横断,这和实验A组动物BBB评分最高为8分及组织化学、追踪检测结果一致,说明用刮胡刀片切断脊髓是可以做到全横断的,但不能保证每次都没有组织残留。有的研究者为了保证每次全横断没有组织残留,采用全切前脊髓腹侧穿线或全切后抬起脊髓断端的方法,但这样对脊髓或脊髓残端牵拉较重,加重损伤,不利恢复。其次,脊髓损伤后早期和延迟的血管反应,包括实质内的出血,炎症,血脊髓屏障的破坏和血管生成等不仅影响继发组织伤害的演化,而且决定了伤后脊髓中促进神经再生的环境。大鼠脊髓的动脉供应主要有脊髓腹动脉和两侧的脊髓背动脉,它们的分支围绕脊髓形成动脉冠,供应脊髓;脊髓静脉回流主要依赖脊髓腹、背静脉。用重物下坠致伤模型或本实验对照组全横断的方法将破坏损伤区及邻近脊髓的动脉供应和静脉回流,文献报告损伤区表现为出血、炎细胞浸润和血脊髓屏障的破坏,随后出现血管痉挛、组织水肿和组织缺血。我们设计的模型中保留了这些主要供血和回流血管,会大大减少因出血和缺血引起的原发损伤和继发性伤害,也为损伤区及邻近脊髓组织从创伤中恢复和再生提供了良好营养支持。另外,现常用的脊髓全横断模型有的是开放性损伤,周围组织易侵入损伤区,将脊髓两断端隔离,不利脊髓再生。我们对照组模型中就见NF反应组织分隔开脊髓两断端,而我们设计的模型,全横断脊髓后缝合硬脊膜和蛛网膜,形成闭合性伤口,阻隔了周围组织侵入,利于脊髓断端的解剖对位,我们H.E.染色及免疫组织化学结果中可见实验A组脊髓两断端和损伤区