反相高效液相色谱法测定离子液体溴化1-乙基-3-甲基咪唑-水体系中青蒿素的含量

反相高效液相色谱法测定离子液体溴化1-乙基-3-甲基咪唑-水体系中青蒿素的含量

1青蒿素的提取有效抗疟疾药物是黄艾酒和黄艾酒。它是一种含有过氧基的新半醇。青蒿素易溶于丙酮、氯仿、乙酸乙酯,可溶于甲醇、乙醇,微溶于冷石油醚,几乎不溶于水。目前,工业上主要利用6号溶剂油(主要成分为正己烷)、石油醚、乙酸乙酯等易燃、易爆、强挥发性的有机溶剂反复浸提生产青蒿素。虽然可以通过蒸发实现大部分溶剂回收和循环利用,但它们易燃、易爆的特性加大了溶剂储存的费用,同时也是青蒿素生产厂周围大气污染的重要源头。因此,开发非挥发性溶剂提取青蒿素新技术具有重要意义。离子液体(ionicliquid)是一类由有机阳离子和无机阴离子结合而成,在室温下呈液态的盐类化合物。其主要特点是:几乎没有蒸汽压,热稳定性和化学稳定性高,能溶解大多数无机物、金属配合物、有机和高分子化合物。常见的离子液体阳离子有烷基取代的咪唑阳离子、吡啶阳离子和季铵阳离子等;常见的阴离子则有氯离子、溴离子以及四氟化硼阴离子和六氟化磷阴离子等。本实验室开发了一种水溶性咪唑类离子液体溴化1-乙基-3-甲基咪唑([EMim]Br)提取黄花蒿中青蒿素的新技术。该离子液体因为其咪唑环上取代基为短碳链,粘度较低,已经实现初步工业化生产,价格相对低廉。[EMim]Br可以与水互溶,所以可通过加入几乎不溶解青蒿素的溶剂水进一步降低其粘度,利于黄花蒿粉末与提取剂的充分混合和液固分离操作。此外,该[EMim]Br-水体系可与易溶解青蒿素的乙酸乙酯清晰分层,可以通过萃取分离实现青蒿素的富集,同时实现[EMim]Br-水的回收和循环使用。采用有机溶剂提取黄花蒿原料后,可将含青蒿素的有机溶剂蒸发回收,再将含青蒿素的浸膏溶解于无水乙醇或甲醇中直接进行高效液相色谱检测。而离子液体[EMim]Br-水体系作为提取剂,因其无挥发性,不能通过蒸发回收溶剂,所以需要建立一种新的检测方法,直接检测[EMim]Br-水体系提取液中青蒿素的含量。2实验部分2.1超声波发生器、青蒿素、甲醇、仪器LC-20AT岛津高效液相色谱仪(包括SPD-M20A二极管阵列检测器、SIL-20A自动进样器、LCsolution液相色谱工作站,日本岛津公司);120D超声波发生器(北京弘祥隆生物技术开发有限公司);8002型恒温水浴控制器(余姚明伟仪表厂)。干燥黄花蒿粉末(贵州遵义);青蒿素标准品(中国药品生物制品检定所,批号100202-200402,纯度≥99%);溴化1-乙基-3-甲基咪唑([EMim]Br,本实验室合成);甲醇(色谱纯,美国Fisher公司);无水乙醇(分析纯)、石油醚(30～60℃)、NaOH、HAc、NaAc(北京化学试剂公司)。超纯水由美国Millipore公司Mill-QAcademic水纯化系统制备。2.2实验方法2.2.1保护柱、流动相、naac色谱柱:迪马(Diamonsil)C18柱(250mm×4.6mm,5μm);保护柱:迪马(10mm×4.6mm,5μm);流动相:V(甲醇)∶V(0.01mol/LHAc-NaAc溶液,pH=5.9)=60∶40混合溶液;进样体积:20μL;检测波长:260nm;流速:0.5mL/min;柱温:(25±1)℃。2.2.2青蒿素标准品溶液青蒿素本身没有强紫外吸收,但是青蒿素与0.2%(m/m)NaOH溶液反应后再通过HAc调节pH至5.58～6.04,可以生成有强紫外吸收的物质Q260,利用Q260可以实现对青蒿素的定量检测。准确称量适量青蒿素标准品于10mL容量瓶中,并用V([EMim]Br)∶V(H2O)=1∶4的混合溶液溶解并定容,配制成50、100、150、200、250和300mg/L标准品储备液。分别取出1mL上述青蒿素标准品储备液至10mL容量瓶,加入4mL0.2%NaOH溶液,将容量瓶置于50℃水浴反应30min后冷却至室温,以0.4%HAc定容至10mL,经0.22μm滤膜过滤得稀释10倍的青蒿素标准品待测液,浓度依次为5、10、15、20、25和30mg/L。2.2.3样品处理和检测取一定质量黄花蒿粉末进行超声提取和索氏提取,实验步骤见文献。3结果与讨论3.1色度条件的选择3.1.1色谱条件的确定以甲醇-水(HAc调节pH=5.9)为流动相时,青蒿素峰不能与临近峰完全分离,且脱尾严重,峰形较差;加入NaAc则可以改善脱尾。分别考察0.005、0.010和0.015mol/L的NaAc溶液对拖尾的影响。NaAc浓度为0.005mol/L时,脱尾现象严重;当浓度提高到0.010和0.015mol/L后,分离度明显改善。考虑到高浓度盐会影响色谱柱和泵的寿命,因此选择水相中NaAc浓度为0.01mol/L。当V(甲醇)∶V(NaAc溶液)>70∶30时,流动相洗脱能力过强,青蒿素峰与临近各峰不能完全分开;当V(甲醇):V(NaAc溶液)<50∶50时,灵敏度下降,保留时间迅速增加;当V(甲醇)∶V(NaAc溶液)=60∶40时,青蒿素色谱峰与临近各峰分离度好,且出峰较快。Q260在pH5.58～6.04之间都可以稳定存在,但是在pH5.9时峰形和分离效果最好,所以洗脱液的pH值都用HAc调至pH5.9。3.1.2青蒿素保留时间实验考察了0.2、0.5、0.8和1.0mL/min4个流速。流速为0.2mL/min时,青蒿素保留时间为28min,检测时间过长;流速为0.8mL/min时,青蒿素与临近峰部分重叠,分离效果较差;流速为0.5mL/min时,分离效果良好,青蒿素在15min内出峰,所以流速选择0.5mL/min。3.1.3青蒿素检测条件v根据以上实验结果,综合考虑青蒿素峰分离效果和色谱检测时间,选择V(甲醇)∶V(0.01mol/LHAc-NaAc溶液,pH=5.9)=60∶40混合溶液为流动相,流速为0.5mL/min,检测波长为260nm,柱温为(25±1)℃时,青蒿素可以快速被检出,同时分离效果良好。3.2青蒿素标准品溶液以浓度为5、10、15、20、25和30mg/L的青蒿素标准待测液进样分析,进样量20μL(图1)。使用外标法,横坐标为青蒿素标准品浓度,纵坐标为峰面积,回归方程:y=2.20326×107x-30928.7。相关系数r=0.9990,证明在5～30mg/L浓度范围内,峰面积与青蒿素标准品浓度呈良好的线性关系,可以进行青蒿素样品的定量计算。3.3保留时间和峰面积相对标准偏差取浓度分别为5、10、15、20、25和30mg/L青蒿素标准溶液分别重复进样6次分析。6个浓度对应的峰面积相对标准偏差分别为0.11%、0.29%、0.03%、0.14%、0.09%和0.04%,保留时间的相对标准偏差分别为0.03%、0.02%、0.02%、0.01%、0.01%和0.01%。实验结果表明本方法精密度良好。3.4检测方法的重复性重复检测样品待测液6次,进样量20μL(图2)。峰面积的相对标准偏差为0.12%,保留时间的相对标准偏差为0.01%,该检测方法有良好重复性。每4h对样品溶液进行检测,24h内测定6次,峰面积的相对标准偏差为0.11%,保留时间的相对标准偏差为0.01%,本方法在24h内稳定。3.5青蒿素检出限浓度用V([EMim]Br)∶V(H2O)=1∶4混合溶液逐步稀释青蒿素标准品溶液,信噪比(S/N)为3时,青蒿素的检出限浓度(LOD)为0.2mg/L;信噪比(S/N)为10时,青蒿素的的最低定量限浓度(LOD)为0.6mg/L。3.6样品检测结果将青蒿素标准品加入青蒿素浓度已知的样品溶液中,按照处理标准品的方法制备待测液。进样量20μL,检测结