电针神经干细胞对脊髓全横断大鼠术后运动功能恢复的影响

电针神经干细胞对脊髓全横断大鼠术后运动功能恢复的影响

根据现有的神经干预研究，对脊柱损伤的移植（ius）进行了治疗。其目标是观察移植到骨髓中的nsi在骨髓中的生存、迁移、分化和修复受损骨髓的组织结构。这些研究表明,NSCs移植在治疗脊髓损伤方面有一定的应用前景。国内许健鹏和徐斌等应用督脉电针治疗脊髓损伤病人,观察到患者的运动功能有一定的恢复。我们也应用督脉电针治疗全横断脊髓大鼠,发现受损伤脊髓组织结构和后肢运动功能有一定的修复。最近有研究表明,针刺促进受损伤脊髓发生可塑性变化与其表达神经营养素-3(neurotrophine-3,NT-3)增加有关。为此,本研究联合应用督脉电针与神经干细胞移植,为临床脊髓损伤探索新的治疗策略。材料和方法1.每组的gg的分组将20只成年雌性SD大鼠(体重220～250g)分为4组,每组5只;即督脉电针+神经干细胞移植组(电针神经干细胞组)、督脉电针组(电针组)、神经干细胞移植组(神经干细胞组)和对照组。2.动物单次注射激素在上述4组动物腹腔内注射戊巴比妥钠(25～30mg/kg)进行麻醉,在无菌条件下切开皮肤,分离肌肉,切除T8和T9脊柱椎板暴露脊髓,在T10脊髓段做全横断。随后在横断处填入约2mm×2mm×2mm的明胶海绵。其中电针神经干细胞组和神经干细胞组的明胶海绵内含有10μl神经干细胞,电针组和对照组的明胶海绵内含有10μlDMEM/F12培养液。逐层缝合肌肉和皮肤。术后每只动物腹腔内注射青霉素5万单位/d,连续3d,人工排尿。术后各组动物均饲养65d。3.神经胞培养液制备在无菌条件下获取SD乳鼠(出生1～2d内)的海马,置D-Hank液中剪碎,放入离心管离心后去上清液,再加入0.25%胰蛋白酶消化10min(37℃)。用含有胎牛血清的培养液终止酶消化,经离心后弃上清液。加入DMEM/F12(含20μg/LbFGF和20ml/LB27)无血清培养液,用吸管吹打成细胞悬液。用200目滤器过滤细胞,离心弃上清液。再加入DMEM/F12培养液,行细胞计数后制成1×104个细胞/ml的细胞悬液移入培养瓶,置37℃、5%CO2培养箱内进行培养。每5～7d半量更换培养液,行传代培养。取第2代培养7～8d的神经干细胞,用核荧光Hoechst33342(10mg/LMDEM/F12培养液配制)孵育2h。收集核荧光标记好的神经干细胞,经细胞计数后制备浓度为8×106个细胞/μl的神经干细胞悬液,抽取10μl细胞悬液注入到脊髓横断处的明胶海绵内。核荧光标记移植细胞的目的是追踪移植入脊髓横断处的神经干细胞存活和分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞情况。4.腰椎近同穴中主刑两种典型脉内固定电针神经干细胞组和电针组动物在术后第5d开始接受隔日1次的电针治疗。选择2组穴位:第1组为两个督脉阿氏穴,位于脊髓横断处上、下约两个脊髓节段(T7～8和T11～12)的椎体棘突之间。第2组为督脉的脾俞和长强穴。在这4个穴位的进针深度为穿皮后再进针约2mm,刺激强度为12～15mV(以观察到动物全身肌肉轻微颤动为度),频率为疏密波,留针时间为15min。5.术后运动能力测试对4组动物进行日常行为学的拍摄录像。参照Basso等提出的脊髓损伤大鼠功能恢复评判标准(BBB评分法),对所有动物后肢运动能力进行评估。采用Ramon-Cueto等的爬网格测试方法,对术后4组动物进行爬网格训练(45°斜坡),观察其后肢运动的恢复情况。BBB评分和爬网格测试均在术后55d～58d进行,每只动物各测试3次,测试时间为:BBB评分2min/次;网格测试5min/次,取平均分值。6.皮质诱发电位测量各组动物均在术后65d进行电生理测试。采用氯醛糖(20mg/kg)和1%戊巴比妥钠(30mg/kg)联合腹腔注射麻醉后,将大鼠固定于脑立体定位仪上,暴露双侧坐骨神经。参照大鼠脑立体定位图谱,在对应双侧皮质躯体感觉运动区的部位打开颅骨,剥去表面脑膜,暴露大脑皮质。将1根电极与坐骨神经接触,另1根电极与大脑皮质表面接触。另外,参考电极插入头皮下,地线插入鼠尾。所有电极均接驳在Biolap-410智能型生物信号显示与处理仪上。测试时先在一侧坐骨神经上的电极接刺激电源,同时在相应大脑皮质上的电极接记录端口。选用粗电压作单刺激,波宽1ms,强度1mV,记录皮质体感诱发电位(corticalsamatosensoryevokedpotential,CSEP)。每只动物分别收集10个以上的稳定波型。然后更换电极连接,即坐骨神经上的电极接记录端口,而大脑皮质上的电极接刺激电源,记录皮质运动诱发电位(corticalmotorevokedpotential,CMEP)。记录完一侧的诱发电位后按同样方法检测另一侧坐骨神经与躯体感觉运动区皮质之间的诱发电位。测量所有大鼠的CSEP和CMEP潜伏期(latency)和峰峰值(amplitude),并进行统计学分析。7.织物检测7.1动物样品的采集用1%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔内注射麻醉上述术后65d的4组动物,开胸经左心室插管至主动脉。先快速灌注每100ml含1%亚硝酸钠0.2ml和肝素200IU的生理盐水约180ml,随后灌注含有4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)固定动物。取T8～T12脊髓段置入上述新鲜固定液中做后固定(4℃过夜),再放入30%蔗糖溶液浸泡至沉底(4℃)。将T8～T12脊髓段作连续冰冻纵切片,片厚均为20μm。组织切片先在荧光显微镜下观察、拍摄核荧光标记的神经干细胞,再留作免疫细胞化学及组织学染色。7.2组织切片及显色试剂取各组动物T8～T12脊髓段纵切片分别做nestin、NF(neurofilament)和GFAP(glialfibrillaryacidicprotein)免疫细胞化学染色。3种一抗均购自SantaCruzBiotechnology公司,二抗、生物素及DAB显色试剂均购自博士德公司。nestin、NF和GFAP的一抗工作浓度为1∶600。先用H2O2-甲醇液固定组织切片20min,洗3次,各5min;用正常山羊血清封闭20min;室温下滴加一抗孵育2h,洗3次,各5min;生物素化二抗孵育30min,洗3次,各5min;SABC复合液孵育20min,PBS洗4次,各5min;DAB显色约3min。经脱水、二甲苯透明后,中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照染色。7.3荧光标记检测在放置显微测试方格的显微镜下分别计数脊髓横断处附近即显示核荧光标记又具有nestin、NF或GFAP免疫细胞化学染色阳性的双标细胞。每只动物计数5张切片,每张切片测4个视野,每组5只动物共计测试100个视野。测试数据进行统计学处理。7.4四肢肌肉的重量将固定好的4组动物后肢肌肉按肌群组分离,并称量其湿重,比较各组间的肌肉湿重差别,并行统计学分析。结果1.行为测试的结果1.1术后关节活动观察对照组大鼠经T10脊髓段全横断手术后,其后肢随即完全瘫痪。此组动物在地面或斜坡网格爬行时,双后肢通常被拖在身体的后方(图2),没有观察到后肢关节活动,按BBB法评分为0分。而其他各组大鼠在连续2min地面爬行过程中,后肢均显示不同程度的关节和肌肉运动。依BBB评分测评,电针神经干细胞组评分优于电针组和神经干细胞组(表1)。1.2组大鼠术后运动情况术后50d,每组5只受试动物在5min内应用后肢爬行0.7m长、45°斜面的网格坡道,并攀上平台。对照组大鼠后肢无运动,只能依靠前肢拖行(图2),该组无1只攀上平台。其他3组大鼠均能不同程度地利用后肢运动攀爬,有些还能用后肢支撑爬行(图3)。神经干细胞组有2只攀上平台;电针组有3只攀上平台;电针神经干细胞组有5只攀上平台。2.髓内提高--三亚甲基-3-现有小鼠骨髓中主反应波形的检测正常大鼠皮质体感诱发电位(CSEP)和皮质运动诱发电位(CMEP)的主反应均呈先正后负的PN型波(图1)。当脊髓全横断后立即检测CSEP和CMEP,记录到的波形均无明显的PN波型或近水平的规则波浪线(图1)。存活65d的4组脊髓全横断大鼠均能检测到主反应波形。不论是CSEP还是CMEP,从潜伏期和峰峰值都能看出脊髓损伤后可导致诱发电位发生显著的潜伏期增长和峰峰值变小(图1)。经电针刺激治疗后,电针神经干细胞组的潜伏期和峰峰值均较电针组和神经干细胞组有较明显的改善,但与正常大鼠比较(特别是峰峰值)有显著性差异(表2,3)。3.免疫细胞化学染色采用纵切面、HE染色观察各组大鼠脊髓损伤区组织,可大致划分为3个区域:脊髓残端、网状区和疤痕结构,而移植神经干细胞主要集中在脊髓残端与网状区的交界处。免疫细胞化学染色显示神经干细胞移植区含有核荧光标记的nestin阳性细胞(图6,7)、NF阳性细胞(图8,9)和GFAP阳性细胞(图10,11),表明移植的神经干细胞已有部分分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞,并长出突起(图4,5)。细胞计数显示电针神经干细胞组双标阳性染色的细胞数量与神经干细胞组比较有明显增加(表4)。4.电针神经干细胞和电针神经干细胞对大鼠肌群湿重的影响双侧后肢肌群湿重称量显示(表5),肌肉萎缩最明显的是对照组,而萎缩较轻的是电针神经干细胞组和电针组,这两个组大鼠的肌群湿重无显著性差异。因此,提示电针刺激能减少(或延缓)脊髓全横断大鼠双侧后肢肌肉萎缩。督脉电针治疗髓中神经胞体的电针刺激是落实髓神经功能的重要方法已有研究表明,移植的神经干细胞能在脊髓损伤区存活、迁移和分化,同时能促进脊髓损伤大鼠肢体运动功能的恢复。据认为,这与脊髓损伤区及其邻近组织分泌的神经营养因子所起的作用有关。本研究也观察到同样的结果,神经干细胞移植区有带有核荧光标记的nestin阳性细胞、NF阳性细胞和GFAP阳性细胞,表明移植的神经干细胞已有部分分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞。移植的神经干细胞一方面受到脊髓损伤区及其邻近组织分泌的内源性神经营养因子的影响;另一方面它们也可能会合成和分泌一些神经营养活性物质。在这两类神经营养活性物质作用下,有可能促使脊髓损伤区的结构恢复,从而促进脊髓全横断大鼠后肢运动功能的恢复。但是,这种运动功能恢复的程度是有限的。为了能更好地促进脊髓全横断大鼠后肢运动功能的恢复,本研究联合应用神经干细胞移植与督脉电针,利用电针刺激引起脊髓全横断损伤大鼠机体反应,促使其脊髓合成和分泌更多的内源性神经营养因子,从而促进移植的神经干细胞存活和分化以及修复受损伤脊髓大鼠的后肢运动功能。临床上一直有用督脉电针治疗脊髓损伤病人的方案,并取得一些疗效。选择督脉进行电针刺激与其在机体走行和分布有关。中医针灸理论认为,督脉循行于脊柱正中,手、足三阳经均与督脉交汇,具有总督一身之阳经、调节阳经经气的作用。所以采用针灸治疗脊髓损伤时,督脉是首选穴位。本研究选择一组督脉阿氏穴是位于脊髓全横断处上、下两个脊椎的棘突间;另一组为督脉的腰俞穴和长强穴。腰俞穴正对应于脊髓马尾的根部,在此穴给予电针刺激可能会影响到分布在腰、骶部的诸多脊神经的分支。而长强穴是支配阴部和尾部神经必经之处。从解剖学构造看,这4个穴位的电针刺激可以直接作用于脊髓创伤处邻近脊髓节段和腰、骶段脊髓所发出的脊神经分支,从而影响脊髓内部结构的变化。从我们先前采用督脉电针治疗脊髓全横断大鼠的研究知道,督脉电针治疗后脊髓损伤处的组织溃变减轻,空泡减少变小;大脑皮质感觉运动区和脑干红核的神经元胞体密度恢复性增加;在脊髓横断处尾侧组织注射荧光金逆行标记再生神经纤维,观察到脊髓横断处头侧端的脊髓组织、脑干红核和大脑皮质感觉运动区有少量被荧光金标记的神经元胞体。这表明,督脉电针治疗不仅能减轻脊髓的继发性损伤,而且能促使受损伤的中枢神经元存活及其轴突再生。这可能与上述研究中观察到督脉电针治疗后,受损伤的脊髓组织内生长相关蛋白-43(growthassociatedprotein-43,GAP-43)表达增强有关。已知GAP-43是神经元特有的一种磷酸化糖蛋白,在神经元发生、发育及其轴突再生以及突触形成中起重要作用。在本研究中,联合应用督脉电针与神经干细胞移植治疗的脊髓损伤大鼠,其后肢关节和肌肉活动、后肢攀爬运动、诱发电位潜伏期和峰峰值以及后肢肌肉萎缩程度等指标都得到较明显的改善,表明督脉电针治疗与神经干细胞移植之间有较好的协同作用。这为继续研究督脉电针与神经干细胞移植联合应用促进脊髓全横断大鼠后肢运动功能恢