梯度洗脱反相高效液相色谱hplc-二极管阵列检测糕点中的丙酸钙

梯度洗脱反相高效液相色谱hplc-二极管阵列检测糕点中的丙酸钙

氨基丙酸钙（c2h5coo）2c是近年来我国开发的一种新型酸食品海防材料。在酸性条件下,产生游离丙酸,具有抗菌作用,对各类霉菌、革兰氏阴性杆菌或好氧芽孢杆菌有较强抑制作用,还可以抑制黄曲霉素产生,而对酵母菌无害。丙酸(C2H5COOH)是人体代谢过程中的一种产物和反应物,丙酸钙分解后的Ca可被吸收,所以丙酸钙是一种安全性可靠的食品防霉剂。我国GB2760-2010《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定,丙酸钙可用于豆类制品、生湿面制品、面包、糕点、醋、酱油、饮料等食品中,本文主要研究糕点中丙酸钙的检测。食品中丙酸钙的检测方法主要有高效液相色谱法气相色谱法离子色谱法。气相色谱法定性定量能力较差,为寻找简单、快速、准确、实用的方法,本研究建立一种高效液相色谱法测定糕点中丙酸钙方法。1实验部分1.1实验试剂与标准液的配制HPLC-1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)配有二极管阵列检测器;KQ800DB型数控超生波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);EASYPUREⅡ型超纯水器(北京普析通用仪器有限责任司);BSA2245-CW电子分析天平(北京赛多利斯公司);H-2050R型低速冷冻离心机(北京离心机公司);IKAT25型组织捣碎机(上海标本模型厂);pH纸(天津市塘沽区化学试剂厂);0.45μm微孔滤膜(天津市东康科技有限公司);磷酸、磷酸氢二铵、丙酸钙、纳他霉素、甲醇、乙酸铵、冰醋酸均为色谱纯,实验用水为超纯水。(1)丙酸钙标准储备液:准确称取丙酸钙1.26g用水溶解后定容100mL容量瓶中,配制成丙酸含量为10mg/mL的标准储备液。(2)1.5g/L磷酸氢二铵:称取磷酸氢二铵1.5g,加水溶解后定容至1000mL容量瓶中。(3)lmol/L磷酸溶液:加人3.4mL浓磷酸,混匀加水定容至50mL容量瓶中。选择以下几种市售糕点进行分析:月饼,绿豆糕,夹心蛋糕。1.2流动相和检测方法色谱柱:AgilentZORBAXSB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm,安捷伦公司);柱温25℃;流速1.0mL/min;流动相A:甲醇,流动相B:为1.5g/L磷酸氢二铵,用磷酸调整pH值4.5-5.5,检测器:二极管阵列检测器,选取214nm、305nm;进样量:10μL。按(表1)进行梯度洗脱。1.3校准曲线的绘制准确吸取5.0mL丙酸钙标准储备液用水稀释至50mL容量瓶,配制成浓度为1.0mg/mL标准溶液,再吸取标准储备液0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL至10mL容量瓶中,分别加入1mol/L磷酸溶液0.2mL,用水稀释至10mL混匀。其丙酸钙标准溶液的最终浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,浓度由低到高进样,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制校准曲线。在上述色谱条件,根据保留时间定性,外标峰面积法定量。式(1)中,X:样品中丙酸钠(钙)含量(以丙酸计),g/kg,如以丙酸钠计乘以1.2967,以丙酸钙计乘以1.2569;C:由标准曲线得出的样液中丙酸的浓度,mg/mL;V:样液最后定容体积,mL;m:样品质量,g;f:稀释倍数。1.4样品处理和转导准确称取5g试样至100mL烧杯中,加水20mL,加入1mol/L磷酸溶液0.5mL混匀,经超声浸提15min后,用1mol/L磷酸溶液调pH值至4.5-5.5左右,转移试样至50mL容量瓶中,用水稀释至刻度摇匀。将试样全部转移至50mL具塞塑料离心管中,以不低于4000r/min离心10min,取上清液,经0.45μm微孔滤膜过滤后,待液相色谱测定。2结果与讨论2.1丙酸钙的提取丙酸钙是新型防腐剂,易溶于水,微溶于甲醇、乙醇等有机溶剂,而在酸性条件下,丙酸钙转化成丙酸,所以选取pH值4.5-5.5纯水提取丙酸钙。常用的样品提取方法有振荡提取和超声提取,由于超声利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速分子运动,使细胞内有效物质的释放、扩散和溶解,可以显著提高提取效率,所以选择超声提取法提取15min。以此方法提取丙酸钙回收率在90%-101%。2.2方法的回收率和精密度(1)以20%甲醇水做流动相:根据极性有机化合物丙酸易溶于水的特点,选择20%甲醇水做流动相,采用ZORBAXSB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm不锈钢柱)色谱柱,流速在1.0mL/min条件下,进行丙酸标物实验,峰有拖尾。以绿豆糕,夹心蛋糕为代表样品加标试验,进行定量计算,结果杂峰多,相似的光谱图容易干扰,回收率<70%。(2)0.02mol/L乙酸铵溶液+10%甲醇,用冰醋酸调节pH值4.5-5.5采用ZORBAXSB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm不锈钢柱)色谱柱,流速在1.0mL/min条件下,出峰时间6.5min。以绿豆糕,夹心蛋糕为代表样品加标试验,进行定量计算,结果不太满意,回收率<80%。(3)流动相采用1.5g/L磷酸氢二铵,用磷酸调节pH值4.5-5.5采用ZORBAXSB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm不锈钢柱)色谱柱,流速在1.0mL/min条件下,以绿豆糕,夹心蛋糕为代表样品加标做试验,进行定量计算,峰形对称结果满意,回收率>90%。采用梯度洗脱,可以保证丙酸出峰时间3.5min。2.3校准曲线的绘制配制丙酸钙标准系列溶液0、35.5、71.0、142.0、284.0、426.0、568.0、710.0μg/mL,在最佳色谱条件下进样测定(3次平行),得到相应峰面积,数值见表2。以浓度(μg/mL)为横坐标,峰面积(UV·S)为纵坐标绘制校准曲线,得到回归方程为:y=212001.8x-559.0,相关系数:r2=0.99990。结果表明,丙酸钙在35.5-710.0μg/mL范围内具有良好的线性关系。2.4丙酸钙的测定对月饼,绿豆糕,夹心蛋糕三类样品各进行三次平行试验,所检样品中均含有丙酸钙,结果见表3,经过计算产品中丙酸钙含量均符合GB/T2760-2010食品安全国家标准食品添加剂使用标准)的标准。图1为某品牌夹心蛋糕测定的丙酸的色谱图。2.6方法的检出限和定量限按上述实验条件,将标准溶液连续稀释后进行绿豆糕,夹心蛋糕空白样品的加标回收,根据3倍噪音的响应值和10倍噪音的响应值计算,方法检出限0.03g/kg,方法定量限0.10g/kg。3结论2.5标准曲线、定量限、检测限向已知浓度的绿豆糕和夹心蛋糕中按质量百分比加入一定量标准样品溶液进行测定,计算测定结果的回收率,如表4所示,回收率高于90%,能够满足检测要求。综上所述,样品前处理和流动相中加入磷酸溶液,作用