登革病毒感染小鼠模型的构建

登革病毒感染小鼠模型的构建

病毒是黄病毒属的成员。这是一个有膜的单带病毒。它传播到埃及和白纹病毒。它在亚热带和亚热带地区广泛流行，没有得到有效控制。目前登革热在非洲、美洲、东地中海、东南亚和西太平洋地区100多个国家呈地方性流行,东南亚和西太平洋地区受登革病毒影响尤为严重。DV有4种血清型(DV1—4),可引起登革热、登革出血热和登革热出血综合征,致病机制尚未阐明,缺乏合适的动物模型是主要原因之一。最近几十年登革病毒感染病例数大幅上升,WHO估计每年全球约有5000万登革病毒感染者,其中50万人需住院治疗,约2.5%死亡。研究人员正在努力构建登革病毒感染动物模型,用于登革病毒的致病机理、免疫机制、药物检测和疫苗评价研究。1可用于疾病亲属和疾病原因的动物模型研究1.1登革病毒的复制位点登革病毒感染及病情严重程度受多种因素的影响:(1)宿主,包括遗传的因素;(2)病毒的特征,包括毒力和细胞嗜性;(3)免疫反应,包括免疫保护作用和免疫增强效应。利用针对非结构蛋白NS3的抗体识别正在复制的登革病毒所在的细胞可确定登革病毒的亲嗜性。已在人体尸检标本中发现脾和淋巴结的巨噬细胞和树突细胞均被感染。与之类似,在小鼠的脾、淋巴结和骨髓中的吞噬细胞中都检测到了NS3蛋白。在病毒扩散至全身前,这些细胞会转移到登革病毒复制的淋巴结内,并发现有骨髓中的骨髓细胞和肝细胞被感染的现象。在登革病毒抗体依赖增强效应(ADE)小鼠模型中,还发现登革病毒可在肝窦内皮细胞中复制。然而,人类感染登革病毒后是否也会出现同样的情况,还有待于进一步的研究。登革热的临床症状包括发热、皮疹、血小板减少(血小板计数≤100000个/mm3)、肝中的酶数量上升、出血和血浆渗出。血小板减少是感染登革病毒后最重要的症状之一,可见于病程的各个阶段,当血小板计数低于50000个/mm3,可认为是出现重症的前兆。严重的血小板减少可与血管渗漏综合征有关,其原因包括:血小板相关IgG即抗血小板抗体引起的自身免疫,最终导致血栓性毛细血管病;弥漫性血管内凝血(DIC);骨髓抑制,从而诱导早期的后发感染、前期的发热和退烧后的噬红细胞现象。血管损伤是登革病毒感染后的另一个病理表现。在登革出血热患者皮肤活检的毛细血管中,发现有明显的变形和膨胀,但没有严重损伤。血栓调节蛋白是内皮损伤的重要标志,在有弥漫性血管内凝血和登革患者体内均会增加。而登革病毒感染能否引起弥漫性血管内凝血仍具有争议。另外,纤维蛋白溶解可继发于纤溶酶原的激活,而登革病毒也被证实能直接激活纤溶酶原。此外在登革病毒感染的过程中,还发现了与出血症状有关的抗纤溶酶原抗体。抗NS1抗体可交叉激活不同的凝血分子和凝血细胞,如内皮细胞、血小板和纤维蛋白原。血管渗漏可以导致低血容量性休克,而导致血管渗漏的原因尚不明了,伴有TNFα增加的细胞因子风暴和免疫系统失调都被证实与登革病毒诱导的血管渗透有关。糖氨基葡聚糖,如酸乙酰肝素,是一种带负电的多糖,可让登革病毒吸附并能在血管壁内组成一道阻止蛋白渗漏的物理和电子屏障。多聚糖的破坏或者负电荷蛋白的中和都可能与登革病毒诱导的血管渗透有关。最后,血小板激活因子的激活可诱导增加血管的通透性。总的来说,人类感染和动物模型中的登革病毒的主要复制位点尚未明确。此外,目前还没能建立可靠的重症登革动物模型,但已知部分发病机制可能与血管渗漏综合征的发展有关。1.2不同给药剂量对登革病毒的复制效果影响研究表明蚊子每叮咬一次可传播104~106PFU的WNV,假设登革病毒也处于相同水平,那么感染了104~106PFU登革病毒的动物相当于被蚊子叮咬一次。在皮下接种剂量为105PFU的登革病毒后,NHP可以维持病毒的复制。然而,动物体内的登革病毒复制率远低于人体,仅局限于淋巴组织,并伴有淋巴结病、淋巴球增多症和白血病。另外,使用环磷酰胺可以让登革病毒长期感染恒河猴的单核细胞,环磷酰胺是一种能影响细胞增殖和引起淋巴细胞减少的烷化剂和免疫抑制剂。在皮内接种登革病毒后,部分恒河猴偶尔会出现血小板计数低的情况,但没有其他明显的临床症状。最近发现,静脉内接种猴子更高剂量的登革病毒可以引起出血和凝血障碍,感染后第3d出现瘀点、血肿、与DIC相关的D-二聚体的增加、凝血障碍,但没有发热、厌食或乏力等症状。因此,静脉内注入高剂量登革病毒的恒河猴能够产生类似于人类出血热的症状,并有望应用于登革病毒感染相关凝血障碍的靶向干预治疗的临床前试验。1.3病毒登格病毒感染小鼠模型1.3.1受试小鼠的登革病毒最初建立的登革病毒感染小鼠模型不会出现人类登革热的临床症状,而是发展为嗜神经疾病,这一情况在人群中少见。包括A/J、BALB/c和C57BL/6小鼠在内的免疫活性小鼠支持一定程度的登革病毒复制,出现有限的登革热的特征性症状,如肝损伤、肝脏酶数量的增高、白细胞计数增加、血细胞减少以及红细胞比容增加,A/J和BALB/c小鼠可最终死于麻痹瘫痪。有报道在高度改良的病毒毒株高剂量感染的BALB/c小鼠中可出现与登革出血热相似的症状。在C57BL/6小鼠体表不同的四个点真皮内注射高剂量登革病毒(3×109PFU,DENV-2strain16681),可观察到出血症状,且小鼠内皮细胞可感染登革病毒。感染了高剂量登革病毒的其他免疫活性小鼠也可以发生没有明显症状的内皮损伤以及组织出血。1.3.2ag119小鼠毒力检测感染了登革病毒临床分离株的AG129小鼠被诱导产生了与其他模型相似的神经系统症状。然而,使用小鼠改良的DENV-2D2S10株感染AG129小鼠出现了血管渗漏综合征,与人类常见的严重症状相似。毒力增强的DENV-2D2S10株在E蛋白的硫酸肝素连接域发生突变,可以降低被清除率,引起缺乏IFN-α/β受体的A129和C57/BL6小鼠致命性的疾病。随后发现NS1区发生变异的DENV-D2S10的三斑纯化克隆株S221可引起缺乏IFN-α/β受体的A129小鼠发病。使用高度小鼠改良的DENV-2毒株可引起BALB/c小鼠出现了严重疾病的症状,包括肝损伤、出血症状和血管渗漏,但毒力增强的原因尚未阐明。最近发现未经小鼠改良的登革病毒株能引起免疫功能不全小鼠严重疾病。腹腔注射不同剂量(102-107pfu)的DENV-2D2Y98P株(passage20),根据剂量的不同,可使AG129小鼠出现不同的症状,包括从轻度到重度的疾病,以肝的酶类增加和脾的结构破坏为特征,但没有神经系统症状。一个在NS4B区的变异被认为是导致病毒毒力改变的原因。1.3.3在肿瘤细胞内接种登革病毒SCID小鼠存在T细胞和B细胞的发育障碍,自身缺乏体液免疫和细胞免疫,可以接受异体移植,已广泛用于病毒感染模型的研究。SCID小鼠在感染登革病毒之前,会先移植入肿瘤细胞,登革病毒就接种在这些移植的细胞里。登革病毒可以在SCID小鼠的肿瘤模型中高效复制,先主要感染移植的肿瘤细胞,然后转移到大脑,引起麻痹瘫痪,如K562-engraftedSCID小鼠、Huh7-engraftedSCID小鼠、HepG2-engraftedSCID小鼠。因此,这一模型与登革病毒的亲嗜性和致病机理研究相关性不大,但可以用于药物及疫苗的评价。1.3.4小鼠的人体内免疫反应人类细胞比小鼠细胞更容易感染登革病毒,所以建立登革病毒感染小鼠模型的另一个方法是发展人源化小鼠,如在小鼠体内移植包括CD+43等的人类源性细胞。移植肿瘤细胞到SCID小鼠体内很容易,但是由于其固有免疫反应,包括能阻止移植造血组织的NK细胞,所以移植人类组织入小鼠是很困难的。可将SCID小鼠先与非肥胖糖尿病(NOD)小鼠回交,再与敲除了IL2Rγ的KO小鼠回交。其中NOD小鼠的NK细胞功能缺陷,以及因C5缺乏导致的溶血补体反应缺陷。这种天生缺陷与改良免疫反应的结合让人类的各种细胞和组织可更好地移植到小鼠体内。NOD/SCID/IL2RγKO小鼠和人类CD+43祖细胞的重组使人类不同的细胞可以在小鼠体内生长,包括登革病毒感染的主要靶细胞树突细胞。登革病毒可在不同的小鼠组织中感染人类细胞,包括脾、骨髓、肝及所有与登革病毒感染临床体征相关的组织。在感染登革病毒后,小鼠出现登革热的临床症状,包括发热、红疹和血小板减少,但还没有出现更严重的症状。这些小鼠提供了研究人体内免疫机制的可能性。目前要产生稳定足量的抗体还很困难,难以将抗体产品化,但小鼠通常都能产生针对登革病毒特有的T细胞反应,使其成为研究在持续感染中T细胞交叉反应的重要模型。相反,使用4种不同的低传代数DENV-2或实验室改良的DENV-2感染RAG和IL2Rγ基因缺陷的RAG-hu小鼠,小鼠可出现发热症状,但没有其他症状。另外,大部分的RAG/IL2RγKO小鼠(10/16)都产生了抗登革病毒抗体,其中3只小鼠产生了中和抗体。最近,有一种新的BLT-NSG小鼠模型,它是移植有脐带血造血干细胞的人源化NOD-scidIL2rγnull小鼠,同时移植了人类胎儿的甲状腺和肝组织。研究发现在BLT-NSG小鼠的血清中登革病毒特异抗体滴度增加。另外,在急性期和记忆期由BLT-NSG小鼠的脾细胞产生的B淋巴细胞分泌出DNNV特异性具有中和能力的IgM抗体。BLT-NSG小鼠中的人源性T细胞分泌包括DENV肽池和HLA-A2限制肽的IFN-γ。BLT-NSG小鼠也用于研究对登革病毒疫苗的人类免疫反应和连续登革病毒感染的初始免疫作用。2增加病毒载量流行病学研究表明重症登革与不同血清型的DENV二次感染之间密切相关。在特定条件下,抗DENV抗体可以通过交叉反应产生ADE效应,造成更严重的疾病。ADE效应通过增强登革病毒对含有Fcγ受体的细胞的感染,增加病毒载量。重症登革的免疫致病机理可能与交叉反应的T细胞有关,交叉反应的T细胞通过参与前炎症级联反应,同时产生比同型T细胞更高水平的TNFα和IFN-γ,从而导致细胞因子的紊乱。尽管如此,大多数二次感染异型登革病毒的病人都表现为无症状或典型登革热的症状。因此,适应性免疫应答不仅与免疫致病机理有关,还能对机体产生有效的保护。造成交叉免疫保护和免疫病理损伤这两个截然相反效应的因素还不清楚,而这一问题也成为解决重症登革致病机制及免疫保护机制的关键性问题,对完善疫苗设计有潜在的应用价值。2.1血清型/基因型denv的同源性和免疫反应NHP不能出现临床症状,但能产生与人体内相似的免疫应答。人类初次感染4种血清中的任意一种皆可诱导广泛的可交叉反应的抗体和T细胞应答,但是免疫应答主要针对原感染的血清型。异型登革病毒感染者血清间的交叉反应性相当普遍,尤其是在高保守的NS蛋白表位或E蛋白保守表位,但要区分不同的表位和依赖于各种血清型/基因型DENV同源性的程度。另外,NHP相继感染异型登革病毒可以诱导交叉免疫应答,但针对首次感染血清型的抗体滴度最高,与在人体和小鼠体内观察到的结果相似,这种现象被称为“原抗原之罪”。NHP继发感染DENV会增加出现病毒血症的几率,暗示了ADE效应可能通过交叉反应的抗体增加病毒载量。与之相似,在感染登革病毒之前,抗登革病毒单克隆抗体1A15被动转移,恒河猴发生病毒血症的几率增加3到100倍。细胞免疫在NHP模型中并不明显。有研究发现在感染登革病毒后,会出现T细胞的交叉反应,同时针对初次感染血清型的免疫应答会更强,与在人体内的情况相似。在人体内初次感染的登革病毒可参与登革出血热和登革休克综合征的免疫发病机制中,低亲和度的记忆T细胞会被高度激活。总而言之,在NHP模型中可以看到病毒血症的增加,但没出现血管渗漏或与登革出血热和登革休克综合征类似的症状,因此无法将这一模型运用于致病机理及免疫病理机制的研究。2.2t细胞诱导的免疫致病机制对交叉反应机制的研究:部分免疫缺陷的AG129小鼠能对登革病毒产生广泛的交叉反应和持久的抗体应答。在小鼠模型中,相继感染的登革病毒会引起第二次感染血清型病毒载量的减少和对抗致命性感染的机体保护。另外,已证明T细胞在保护机体方面有重要作用。对DENV-1产生免疫且缺乏T细胞的小鼠在二次感染DENV-2DS210后,出现了疾病的临床症状。目前尚不能建立继发感染登革病毒造成严重疾病的动物模型,但可用于研究由交叉反应的T细胞诱导的免疫致病机制。利用AG129小鼠先感染DENV-1,6至8周后再感染DENV-2,建立了连续感染模型。从在ELISPOT中发现的DENV-1特异性细胞数目增加,以及从在二次感染DENV-2的小鼠分离出的多克隆刺激脾细胞的上清液中,发现抗DENV-1的亲和力增加,都可证实在急性二次感染不同血清型时,DENV特异性亲和力的增加是由交叉反应的记忆B细胞介导的。然而,即使对DENV特异性亲和力增加,对DENV特异性的中和能力是没有增加的,中和能力可能是由幼稚B细胞介导的。将DENV-1免疫B细胞和T细胞转移至已经二次感染了DENV-2的幼鼠,发现死亡率降低了。缺乏T细胞的小鼠会出现症状,但二次感染DENV能痊愈。并发现了保护性交叉抗体是由成熟的浆细胞和记忆B细胞分泌的,且交叉反应的B细胞和T细胞能产生对二次感染异种血清型DENV的保护。最近,利用C57BL/6小鼠模型发现,T细胞的表位对免疫保护和免疫增强有着不同的作用。虽然这些小鼠模型都初步阐明了登革病毒继发感染时交叉反应T细胞的激活模式,但仍未真正建立重症登革模型。因此,要构建出支持病毒复制、自然T细胞应答和重症登革症状的小鼠模型需要更好地阐明T细胞应答在登革病毒二次感染和血管渗漏的作用。2.2.2发病机制的可能通过被动转运抗登革病毒单克隆抗体、交叉反应的免疫血清或稀释的同型血清,已经成功在AG129小鼠和其他小鼠中建立ADE小鼠模型。用抗登革病毒血清预处理小鼠,感染低于致死量的登革病毒剂量(105PFUDENV-2D2S10i.v.)即会死亡。这一预处理可提高小鼠血清及部分组织中的病毒载量,并出现与登革出血热和登革休克综合征相似的症状,包括血管渗漏综合征、血清中TNF-α和IL-10水平增加以及死亡前血小板计数偏低。在使用107PFUDENV-2D2S10的致死性模型中,同样出现了上述所有症状,说明发病机制可能与病毒载量密切相关。高病毒载量可以通过高滴度DENV培养物直接注入,也可以通过ADE效应诱导。值得注意的是,接受血清或抗体被动转移的小鼠并没有对登革病毒产生记忆。免疫记忆的出现可能会限制ADE效应的诱导,连续感染登革病毒的小鼠模型可用于研究记忆细胞免疫应答下的ADE效应。中和抗体的数量似乎对诱导免疫保护还是ADE效应至关重要。最近研发了一种全新的小鼠改良毒株,该毒株可以在IFNAR1-/-小鼠(只缺乏IFN受体)中诱导致命的疾病。使用DENV-3感染IFNγ缺陷小鼠,小鼠会出现严重的症状和病毒的高水平复制,死亡率更高。研究表明,IFNγ的缺乏与一氧化氮合酶2(NOS2)的表达较少以及NOS2-/-小鼠对DENV-3感染敏感性增强有关,对DENV-3的保护机制可依靠IFNγ-NOS2-NO依赖的通道来控制病毒的复制和疾病的严重程度。因此,DENV-3感染的免疫缺陷小鼠重症模型也许能成为阐明疾病的免疫发病机制和保护机制的工具。2.3初次和继发感染间隔时间的延长人体内体液免疫的记忆应答随着时间的推移而减弱,而初次感染和继发感染之间间隔时间的长短可能是发展为重症的关键。由于小鼠的寿命短,小鼠模型并不是解决上述问题最理想的模型,可能NHP模型更适合这一研究。3可用于药物治疗效果评价研究的小鼠模型目前还没有商业化抗登革病毒的特效药物,只有输液用于登革出血热和登革休克综合症的支持治疗。3.1尼姆树胺和板栗树精胺已经将抗病毒候选药物在小鼠麻痹和脑炎模型中进行了评价;但其在人群中的疗效尚不确定,因为药物在中枢神经系统的生物学药效反应与在其他组织不同。尼姆树叶的提取液可抑制病毒复制,防止受感染乳鼠出现临床症状。栗树精胺是一种糖苷酶抑制剂,可抑制病毒蛋白的折叠,降低病毒滴度并使A/J小鼠感染后的死亡率下降。该药和另一种抗病毒药物联合应用于感染了未改良DENV菌株(TSV01)的AG129小鼠中,可有效降低病毒载量和炎症反应。表明登革病毒TSV01株可用于检验准抗病毒药物对病毒血症的治疗效果,并可说明联合用药中不同抗病毒药物的协同作用。3.2ade效应的检测感染小鼠改良的DENV的AG小鼠模型可出现致命的血管渗漏综合征,也被用于抗病毒的试验。药效指标可以是发病率、死亡率、病毒载量、血管渗漏的症状、血小板数量和TNFα等前炎症因子的水平。在出现ADE效应的AG129小鼠中,应用siRNA靶向登革病毒基因组中的5’环化序列,可延长寿命并大幅度降低病毒载量。该模型产生的单克隆抗体无法与Fcγ受体结合,可用于研究预防和治疗用药物。因此,能出现与人类症状相似的免疫缺陷小鼠模型对抗病毒药物的评价非常有效。4临床前疫苗的准备登革疫苗尚未研制成功,部分处于临床试验的1/2阶段。迄今正在研发的登革病毒疫苗有减毒活疫苗、灭活疫苗、病毒样颗粒(VLP)以及以E蛋白、PrM蛋白、NS1蛋白为靶向的亚单位疫苗。临床前疫苗的测试包括安全性、传染性(指活疫苗)、免疫致病性及保护性的评估。由于NHP模型价格昂贵,通常使用小鼠模型作为疫苗临床前研究的第一步。总的来说,免疫活性小鼠是测试疫苗免疫原性最适宜模型。4.1基于登革病毒的免疫反应强度在乳鼠模型中,登革病毒的复制量很低,这可能会导致低估减毒活疫苗的免疫应答强度。感染了登革病毒的免疫活性小鼠,不管是乳鼠还是成鼠,皆可致神经系统疾病并死于麻痹瘫痪。乳鼠是个非常好的测试安全性的模型,可用于评估减毒活疫苗的潜在神经毒力。4.2病毒登格病毒感染跳蚤模型4.4养疫防治模型NHP模型主要用于致病