技术核心材料陆总结报告

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农业部饲料工业中心硫色曲霉β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的高效分泌表达研究中国农业大学农业部饲料工业中心技术总结报告曹云鹤MAFIC

农业部饲料工业中心研究背景

1、硫色曲霉的研究2、β-甘露聚糖酶的研究现状

3、毕赤酵母表达体系的优越性技术工作总结

1、β-甘露聚糖酶基因的克隆

2、重组工程菌株的构建与筛选

3、发酵条件的研究与酶学性质分析相关内容

1、科技查新报告

2、急性毒性试验

3、菌种检测鉴定

4、专利申请MAFIC

农业部饲料工业中心研究背景硫色曲霉：

AspergillussulphureusCGMCC:0608固态发酵可以产生木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶等多种酶类，已经实现了产业化生产。实验室中试工业化生产木聚糖酶(U/g)300022002000β-葡聚糖酶(U/g)230018001600β-甘露聚糖酶(U/g)300270230MAFIC

农业部饲料工业中心已经从硫色曲霉克隆了两种木聚糖酶基因（DQ355509、DQ168666），已经实现了在细菌和毕赤酵母中的高效表达。1、曹云鹤，陈小玲，贺平丽等，硫色曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆、表达及酶学性质分析，生物技术通讯，（Inpress）.2、曹云鹤，贺平丽，陈小玲等，硫色曲霉木聚糖酶基因xynB的克隆、表达及酶学性质分析，中国生物工程杂志，（Inpress）.MAFIC

农业部饲料工业中心2005年，我国大豆产量1800万吨，进口量为2300万吨，其中，80%以上用于饲料。在猪、鸡饲料中豆粕的添加量为20-30%。豆粕：1.2%甘露聚糖研究背景MAFIC

农业部饲料工业中心甘露聚糖的抗营养作用：

甘露聚糖具有高亲水性，在单胃动物的消化道内大量吸水，增加了消化道内容物的粘度，抵抗胃肠的蠕动，直接影响动物对营养物质的消化和吸收

。MAFIC

农业部饲料工业中心

甘露聚糖的完全酶解：

β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)

β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)

α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)

脱乙酰酶(EC3.1.1.6)MAFIC

农业部饲料工业中心甘露寡糖的生理功能调节免疫防御

刺激免疫系统，激活巨噬细胞，免疫佐剂调节非免疫防御

调节胃肠道菌群平衡

吸附毒素黄曲霉毒素米曲霉毒素玉米赤霉烯酮MAFIC

农业部饲料工业中心菌株分子量最适温度最适pH参考文献Bacilluslicheniformis__506.0Zhangetal[7]Trichodermaharzianum32.5553.0FerreiraandFilho[8]Bacillussubtilis3950-557.0Zakariaetal[9]Bacillusstearothermophilus73705.5-7.5TalbotandSygusch[10]Aspergillusfumigatus60604.5Puchartetal[11]63604.5Aspergillusniger40__3.5Ademarketal[12]Sclerotiumrolfsii61.2702.9Gubizetal[13]Trichodermareesei46755.0Arisan-Atacetal[14]β-甘露聚糖酶的研究现状MAFIC

农业部饲料工业中心1、Jackson等研究表明，β-甘露聚糖酶能提高玉米-豆粕型日粮鸡的饲料转化率，并促进肉鸡及火鸡的日增重和饲料利用率，提高蛋鸡的生产性能。2、王春林等报道,低能量饲料添加和美酵素（主要成分为β-甘露聚糖酶）可以提高饲料的转化率，提高鸡的抗病力，改善肉用鸡的健康状况。

β-甘露聚糖酶在饲料中的应用研究3、Pettey等研究表明，日粮添加β-甘露聚糖酶，能显著提高仔猪的采食量，提高仔猪的生长速度和日增重。4、黄小文等报道,大猪日粮中分别添加1000U/g和2000U/g甘露聚糖酶比对照组平均日增重分别提高6.22%和12.99%。MAFIC

农业部饲料工业中心研究背景毕赤酵母表达载体的优越性：1、单细胞，繁殖速度快；2、产物可以分泌到胞外，有利于下游的纯化、处理；3、具有醇氧化酶AOX1基因启动子,这是目前表达能力最强、调控机理最严格的启动子之一；4、表达载体能够在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合，不易发生遗传丢失；5、菌株易进行高密度发酵，发酵工艺简单，外源蛋白表达量高。MAFIC

农业部饲料工业中心MAFIC

农业部饲料工业中心技术工作总结(1)β-甘露聚糖酶基因的克隆及序列分析

根据GenBank公开的刺孢曲霉和里氏木霉的β-甘露聚糖酶基因序列设计简并引物，扩增部分序列，再用RACE-PCR技术克隆末端序列，从而获得全长基因。MAFIC

农业部饲料工业中心P11P2刺孢曲霉与里氏木霉部分基因序列比对MAFIC

农业部饲料工业中心硫色曲霉总RNARNA2

lOligodT1

l5xbuffer5

lMlv1

lRNsin0.5

ldNTP1

lddH2O14.5

l25

l42℃保温1hcDNAMAFIC

农业部饲料工业中心部分基因片段cDNA5

l10xbuffer5

lTaqpol1

lP11

lP21

ldNTP1

lddH2O36

l50

l94℃3min94℃45S49℃45S72℃1min35cyclesMAFIC

农业部饲料工业中心克隆载体(测序引物M13+/-)MAFIC

农业部饲料工业中心β-甘露聚糖酶基因3’-RACEPCR扩增原理图MAFIC

农业部饲料工业中心β-甘露聚糖酶基因5’–RACEPCR扩增原理图MAFIC

农业部饲料工业中心3’–RACEPCR5’–RACEPCRMAFIC

农业部饲料工业中心全长基因的克隆F1（5’-cggaattcatgaagctctccagctc-3’）F2（5’-cccaagcttttaggcgctatcaatagc-3’）MAFIC

农业部饲料工业中心GenBank登录号:DQ328335MAFIC

农业部饲料工业中心MAFIC

农业部饲料工业中心硫色曲霉与刺孢曲霉、里氏木霉的β-甘露聚糖酶基因序列比对MAFIC

农业部饲料工业中心氨基酸序列比对结果MAFIC

农业部饲料工业中心MAFIC

农业部饲料工业中心技术工作总结(2)酵母菌表达载体的构建和重组菌株的筛选

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农业部饲料工业中心MAFIC

农业部饲料工业中心赵翔等,2000.毕赤酵母的密码子用法分析.生物工程学报,16(3):308-311MAFIC

农业部饲料工业中心1GAATTCTTGCCAAAGGCTTCTCCAGCTCCATCTACTTCTTCTTCTTCTGCTTCTACTTCT61TTTGCTTCTACTTCTGGTTTGCAATTTACTATTGATGGTGAAACTGGTTACTTTGCTGGT121ACTAACTCTTACTGGATTGGTTTTTTGACTGATGATTCTGATGTTGATTTGGTTATGTCT181CATTTGAAGTCTTCTGGTTTGAAGATTTTGAGAGTTTGGGGTTTTAACGATGTTACTACT241CAACCATCTTCTGGTACTGTTTGGTACCAATTGCATCAAGATGGTAAGTCTACTATTAAC301ACTGGTGCTGATGGTTTGCAAAGATTGGATTACGTTGTTTCTTCTGCTGAACAACATGGT361ATTAAGTTGATTATTAACTTTGTTAACTACTGGACTGATTACGGTGGTATGTCTGCTTAC421GTTTCTGCTTACGGTGGTTCTGATGAAACTGATTTTTACACTTCTGATACTATGCAATCT481GCTTACCAAACTTACATTAAGACTGTTGTTGAAAGATACTCTAACTCTTCTGCTGTTTTT541GCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCATCTTGTGATACTACTGTTTTGTACGAT601TGGATTGAAAAGACTTCTAAGTTTATTAAGGGTTTGGATGCTGATCATATGGTTTGTATT661GGTGATGAAGGTTTTGGTTTGAACACTGATTCTGATGGTTCTTACCCATACCAATTTGCT721GAAGGTTTGAACTTTACTATGAACTTGGGTATTGATACTATTGATTTTGCTACTTTGCAT781TTGTACCCAGATTCTTGGGGTACTTCTGATGATTGGGGTAACGGTTGGATTTCTGCTCAT841GGTGCTGCTTGTAAGGCTGCTGGTAAGCCATGTTTGTTGGAAGAATACGGTGTTACTTCT901AACCATTGTTCTGTTGAATCTCCATGGCAACAAACTGCTTTGAACACTACTGGTGTTTCT961GCTGATTTGTTTTGGCAATACGGTGATGATTTGTCTACTGGTGAATCTCCAGATGATGGT1021AACACTATTTACTACGGTACTTCTGATTACGAATGTTTGGTTACTGATCATGTTGCTGCT1081ATTGATTCTGCTTAATCTAGA密码子优化改造MAFIC

农业部饲料工业中心EcoRI、XbaI双酶切T4噬菌体DNA连接酶EcoRI、XbaI双酶切pBR322-mann5450bpEcoRIXbaIMAFIC

农业部饲料工业中心阳性克隆的酶切鉴定M12M:Marker;1:EcoRI+XbaI双酶切;2:SacI单酶切.MAFIC

农业部饲料工业中心重组克隆pPIC-mann测序图谱MAFIC

农业部饲料工业中心电击条件：2000V、25μF、5ms1979VMAFIC

农业部饲料工业中心阳性重组菌的PCR鉴定MSSCK-MAFIC

农业部饲料工业中心PCR鉴定菌种的遗传稳定性MCK-15101520MAFIC

农业部饲料工业中心技术工作总结(3)高密度发酵程序：种子液的制备生长阶段流加甘油阶段流加甲醇阶段MAFIC

农业部饲料工业中心挑取重组菌株3#单菌落接种到200mLBMGY培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，4×10-5%biotin，1%甘油，0.1mol/LpH6.0磷酸盐缓冲液），28-30℃、280r/min振摇过夜，获得OD600为3.0左右的种子液。种子液的制备:MAFIC

农业部饲料工业中心配置4LBMGY培养基，在10L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至28℃，接种上述种子液，用氨水和磷酸调节pH至5.5，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于30%。生长阶段：MAFIC

农业部饲料工业中心当接入种子液24h后，甘油消耗完全,进入流加50%（W/V）甘油阶段，流速为60mL/h，连续流加4h。流加甘油阶段：MAFIC

农业部饲料工业中心甘油消耗完全后，进入甲醇流加阶段，流速为12mL/h，控制溶氧20%以上，3h后，将甲醇流速调到24mL/h。再过2h，将流速调到30mL/h，并保持到最后。流加甲醇阶段：MAFIC

农业部饲料工业中心

取经过适当稀释的酶溶液2mL，加入等体积0.8%甘露聚糖溶液，置于相应温度的水浴中，反应30min，加入5mLDNS终止反应。沸水浴煮5min，自来水冷却至室温，蒸馏水定容至25mL，测OD540。酶活性测定：酶活性的定义:每分钟从4mg/ml甘露聚糖溶液中降解产生1μmol还原糖的酶量定义为一个酶活单位。MAFIC

农业部饲料工业中心酶活测定条件:pH2.4、50℃

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农业部饲料工业中心Ｍ０1224487296120144(hr)诱导发酵过程中蛋白表达量的变化MAFIC

农业部饲料工业中心酶活测定条件:40℃

最适pH值及pH稳定性的测定MAFIC

农业部饲料工业中心最适温度及温度稳定性的测定酶活测定条件:pH2.4（℃）MAFIC

农业部饲料工业中心酶动力学参数的测定Km为0.86mg/ml、Vmax为357.14U/mgMAFIC

农业部饲料工业中心Reagents

Relativeactivityoftheenzyme/%Cu2+

106.60Fe2+

109.34Mn2+

96.01Zn2+

96.81EDTA

88.16Na+

112.75Ca2+

96.92Mg2+

102.84Control

100.00MAFIC

农业部饲料工业中心pI3.50pI4.55pI5.20pI5.85pI6.55pI4.89β-甘露聚糖酶蛋白等电点的测定MAFIC

农业部饲料工业中心糖基化作用酶活性的影响MAFIC

农业部饲料工业中心氨基酸测序结果MAFIC

农业部饲料工业中心相关工作科技查新报告文献检索范围（1）国际联机数据库AGRICOLA美国农业文献索引1970-2006AGRISInternational国际农业文献索引1975-2006CABAbstracts国际农业和生物技术文摘1972-2006FSTA 食品科学技术文摘

1990-2006DerwentWorldPatentsIndex德温特世界专利索引1963-2006U．S．PatentsFulltext美国专利全文数据库1971-2006EuropeanPatentsFulltext欧洲专利全文数据库1978-2006（2）国内联机数据库中国学术期刊全文数据库1994－2006

中文期刊数据库1989—2006

中国科技成果库—2005

中国学术会议论文库1986－2005

中国学位论文数据库—2005中国专利数据库1985－2006MAFIC

农业部饲料工业中心1、韦跃华，毛爱军，何永志，乔宇，董志扬．里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达．生物工程学报，2005，(6)．2、谭秀华，武玉永，马立新等．耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达．微生物学报，2005，(4)．3、【申请人】湖北大学．【名称】一种酵母基因工程菌及β-甘露聚糖酶制剂和甘露低聚糖的生