中华哲水珩对麻痹性贝毒毒素的摄入及累积规律研究

中华哲水珩对麻痹性贝毒毒素的摄入及累积规律研究

浮游动物的毒副反应中毒的海洋藻类毒素通过链中毒在海洋贝类和鱼类中积聚，形成水果或鱼毒。通常使用麻痹性苦贝（psp）、腹泻性苦贝（pd）、神经性苦贝（nip）、储存性苦贝（asp）和硫加鱼（cfp）等。其中PSP毒素是世界范围内分布最广、危害最严重的一类毒素。该毒素是一类四氢嘌呤衍生物,主要成分包括石房蛤毒素(STX),新石房蛤毒素(neoSTX),膝沟藻毒素(GTX1-4)和N-磺酰胺甲酰基类毒素(B1-2、C1-4)等。亚历山大藻(Alexandriumspp.)是一类能产生PSP毒素的有害赤潮甲藻,广泛分布于世界沿海海域。在我国黄海、东海及南海海域,均已发现可产生PSP毒素的亚历山大藻或其孢囊的存在。近几年我国东海春季大规模赤潮频发,产毒的塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)为主要肇事藻之一。浮游动物作为海洋初级生产力(藻类)和次级消费者(贝类、鱼类等)间的重要传递媒介,PSP毒素在其体内的累积及排出过程对于该毒素在整个海洋生态系统中的传递具有关键意义。中华哲水蚤(Calanussinicus)是我国近海及日本沿岸海的浮游动物优势种之一,分布广、数量多、个体大,在海洋浮游动物种群动力学中受到广泛关注,在中国近海的分布中心是黄海和东海,是该水域春季的主要浮游动物优势种。本文旨在研究C.sinicus对产毒A.tamarense的摄食情况,以及由该藻产生的PSP毒素在C.sinicus体内的累积及排出过程。1材料和方法1.1暂养点暂养C.sinicus采自青岛近岸海域,以小角毛藻为饵料,持续较弱充气,置于培养箱中暂养数日。有毒藻选用采自东海的A.tamarense(由一所提供),藻类培养液为f/2培养液的改良配方,置于LRH-250G光照培养箱,光源为白色冷日光灯管,光周期L∶D=12∶12。1.2c.singus的体外毒素残留情况将饥饿24h后的C.sinicus置于1L烧杯中,以1000cells/mL密度加入A.tamarense藻液,将烧杯置于10℃培养箱中进行实验。0～12h为摄食实验,12～15h为饥饿实验,研究C.sinicus体内毒素和色素变化;额外增加15～36h饥饿实验,研究C.sinicus在长时间饥饿后体内毒素的残留情况。实验取样共有5部分:在0,3,6,9和12h5个时刻取3mL培养液进行细胞计数,分析藻细胞密度下降情况;在0,3,6,9,12,12.5,13和15h8个时刻对C.sinicus取样,每次用宽头吸管吸出10只用作色素含量分析测定;在0,3,6,9,12,12.5,13,15,24和36h取出10只C.sinicus用作PSP毒素含量分析测定;在12和15h收集烧杯底层全部C.sinicus的粪便进行毒素分析测定;在15h取烧杯中培养海水作毒素分析测定。上述5部分取样实验都进行两次平行操作。1.3样品处理和分析1.3.1高效液相色谱分析C.sinicus及其粪便的PSP毒素提取参照Oshima方法,以醋酸提取,于冰浴中超声破碎,离心沉降,取上清液过0.45μm滤膜待高效液相色谱(HPLC)分析。培养海水直接以0.45μm滤膜过滤后待HPLC分析。HPLC使用InertsilC8色谱柱,柱温30℃,流速1mL/min,柱后衍生以高碘酸氧化,醋酸中和。1.3.2c.sicyus体内色素含量评价参数置于盛有90%丙酮的玻璃匀浆器中研磨,将GF/C膜彻底磨碎后定容至10mL丙酮中萃取色素,24h后,离心沉降,以特纳荧光计测定荧光值求出C.sinicus体内(包括消化道和组织中)叶绿素a和脱镁叶绿酸a含量,并以两者之和作为C.sinicus体内色素含量评价参数。叶绿素a浓度:脱镁叶绿酸a浓度:Pha.a(ng/ind)=0.6633Fd⋅(Ra⋅r−Rb)⋅r⋅Vn(r−1)(2)Ρha.a(ng/ind)=0.6633Fd⋅(Ra⋅r-Rb)⋅r⋅Vn(r-1)(2)式中,Fd为量程档“d”的换算系数,mg/L;Rb为酸化前荧光值;Ra为酸化后荧光值;r为标准叶绿素a的酸化比;V为提取液的体积,mL;n为C.sinicus个数。2结果2.1藻细胞密度下降如图1所示,A.tamarense可以被C.sinicus摄食,藻细胞密度在前3h时间内下降速度比较快,至其初始密度的一半以下,在12h时则降至100cells/mL左右。2.2c.singus的铜绿素含量如图2所示,前12h为摄食实验,12～15h为饥饿实验。在进行实验前C.sinicus体内色素含量几乎为0且未检出含有PSP毒素。色素分析:摄食实验前3hC.sinicus体内色素含量由0迅速增加至25.0ng/ind,余下的时间内含量又逐步下降,在12h降至7.0ng/ind;饥饿实验开始0.5h内色素含量下降幅度最大,降至1.9ng/ind,随后的2.5h内基本保持在这个水平。毒素分析:整个摄食实验中PSP毒素在C.sinicus体内持续累积,在12h达到最高值32.6ng/ind;饥饿实验开始后,C.sinicus体内毒素含量迅速下降,0.5h内降至25.4ng/ind,为最高值的77.9%,随后的时间里这种趋势渐缓,饥饿实验结束时毒素含量维持在19.3ng/ind,为最高值的59.2%;在实验的最后时刻36h,即饥饿实验进行24h后,C.sinicus体内的毒素含量降至8.5ng/ind,为最高值的26.1%。2.3新冠素和型stx、stx、麻黄如图3所示,A.tamarense在被C.sinicus摄食后,其含有的PSP毒素各成分摩尔百分比发生了变化:neoSTX、STX、GTXs比例增加,B1-2和C1-2比例下降,而且出现了原本不含有的STX和GTX1-3毒素。例如,摄食实验开始3h时,C1毒素由4.9%降至2.4%,C2毒素由88.2%降至83.9%,GTX3毒素由0增加至5.4%。在剩余的摄食实验过程中,各毒素成分摩尔百分比基本维持同一水平。2.4不同的脏器中所含的重金属毒素含量通过对12h摄食实验中收集的C.sinicus全部粪便进行毒素含量检测,发现C.sinicus的粪便中含有PSP毒素,其含量为0.423ng/ind,为12h时刻C.sinicus体内毒素累积量最大值的1.3%。而对饥饿实验后收集的C.sinicus粪便进行毒素含量检测发现,其毒素含量近乎为0,同时对C.sinicus培养海水进行毒素检测,结果也未发现PSP毒素的存在。3浮游动物对浮游动物的释放释放可降解所需的合成所释放的合成所释放的合成所释放的合成所释放的合成所释放的合成所含的pvc毒素虽然根据藻细胞密度变化发现C.sinicus可以摄食产毒A.tamarense,但是肠道色素分析结果表明了随着摄食的开始,C.sinicus对有毒藻的摄入量逐步降低。已有研究显示,暴露于有毒亚历山大藻中的纺锤水蚤(Acartiaspp.)会出现活动力减弱以及产卵率下降等现象,本研究可以推断有毒藻还会对桡足类浮游动物的摄食产生影响。随着C.sinicus对有毒藻的摄食,PSP毒素在其体内持续累积,直至摄食实验结束时达到了最大含量。Koji等对大森纺锤水蚤(Acartiaomorii)摄食A.tamarense实验研究表明:在桡足类体内毒素浓度达到10pmol/ind以上时,浮游动物体内对PSP毒素的累积量便呈下降趋势。而在本研究的前期实验中发现,将C.sinicus置于有毒藻A.tamarense环境中6d时间,PSP毒素在C.sinicus体内累积含量高达37pmol/ind左右,出现此结果可能是由于浮游动物存在个体大小差异的缘故。A.tamarense被C.sinicus摄食后,其含有的PSP毒素成分间发生了相互转化的现象,这是由于N-磺酰氨甲酰基类毒素(B1-2、C1-2)容易脱掉磺酰基而生成相应的氨基甲酸酯类毒素(GTXs、STX、neoSTX等);而GTXs毒素间互为同分异构体,β异构体毒素GTX3、4易相应转化为更稳定的α异构体GTX2、1,C.sinicus体内具有一定的酶及酸性环境,促进了这种转化的发生。C.sinicus停止摄食后,在其粪便中检测到的PSP毒素为其体内含量的1%,且培养海水中也未检测到毒素,同时,C.sinicus体内的毒素含量又在明显减少,在饥饿实验进行至24h时,有3/4的毒素消失,这说明C.sinicus可能通过自身的一系列代谢作用使PS