扁穗牛鞭草花粉管萌发的观察

扁穗牛鞭草花粉管萌发的观察

水稻科植物是水稻科植物的一种多年生根草本植物。它在中国西南的无性繁殖和灌溉。根据对四川农业大学1986年育成的‘广益’(H.compressacv.Guangyi)和‘重高’(H.compressacv.Chonggao)扁穗牛鞭草品种多年观测,发现这2个品种在野生状态和人工栽培条件下结实率很低,“花而不实”一直是困惑扁穗牛鞭草研究者的难题。生产上广泛使用的扁穗牛鞭草品种均由无性系选择产生,也多采用无性繁殖的方式进行扩繁,由此限制了扁穗牛鞭草的进一步推广。目前南方地区的人工草地建植及生态恢复重建都选择该草种作为主打草种,但无性繁殖耗费大量人力、物力和财力,给实际生产应用带来了困难,生产上迫切需要扁穗牛鞭草种子,同时提高结实率也是品种改良的关键。目前对该资源的研究主要集中在生态学、细胞学、分子生物学等方面,对其孢粉学的专项研究成果尚未见报道。为此,本试验欲从花粉形态、花粉活力、花粉萌发等方面进行研究,探索‘广益’扁穗牛鞭草结实率低的原因,旨在为扁穗牛鞭草育种研究提供理论依据。1材料和方法1.1试验单元和样品1.1.1土壤条件、湿度试验地位于四川农业大学草业科学系基地(北纬38°8′,东经103°14′,海拔600m),属北亚热带湿润季风气候区。年均气温16.2℃,最热月(7月)均温25.3℃,最冷月(1月)均温6.1℃,极端最高气温37.7℃,年降水量1774.3mm,年蒸发量1011.2mm,相对湿度79%,年日照时数1039.6h,年无霜期304d,≥10℃年积温5231℃。试验地土壤系白垩纪灌口组紫色沙页岩风化的堆积物形成的紫色土,土壤有机质含量14.62g/kg,全氮含量1.91g/kg,全磷含量0.06g/kg,全钾含量11.58g/kg,速效氮含量100.63mg/kg,速效磷含量4.73mg/kg,速效钾含量338.24mg/kg,pH值6.2。试验期间,试验区最高气温(8月中旬)29.04℃;最大湿度和平均湿度(9月下旬)分别为98.33%和76.92%;最大降水量36.16mm。1.1.2试验材料于2006年采自四川农业大学草业科学系种植3年的‘广益’扁穗牛鞭草草地,在其开花期间取小穗进行相关观测。1.2测试方法1.2.1花粉的x射线检测在7-11月整个开花期间,采含苞待放的花直接投入戊二醇溶液进行固定。集花粉标本,对其进行干燥前处理。将处理后的花粉样品均匀地撒在载物台上的双面胶纸上,然后经镀膜机镀膜。把样品置入KYKY1000B-扫描电子显微镜,选择不同放大倍数,不同观察角度,对花粉群体、极面、赤道面、沟间区和萌发孔进行观察和摄影,并对其形态特征要点、各种技术参数进行必要的记载。利用显微摄影后获得的扫描照片,对每种花粉进行体积大小的测量,对表面纹饰、萌发孔结构等形态特征分别进行描述。有关花粉粒表面性状的所有数据均来源于20粒花粉的平均值。1.2.2花粉粒的测定采用碘染色法测定不同花序同一部位上即将开放的小花花粉活力。随机取10个花药于载玻片上,加1滴蒸馏水,用镊子充分捣碎后滴加1或2滴I2-KI溶液染色,用德国生产的LeicaDM5000B显微镜观察花粉粒着色情况,花粉粒完全被染成深蓝色作为有活力花粉粒。每个花位的小花制片10张,每张片观察3~5个视野。统计1个视野中花粉粒的总数和已染色的花粉粒数,计算每个花位观察视野所得到的总数,按下式计算各花位小花的花粉生活力:花粉生活力(%)=被染色花粉粒数/花粉粒总数×100%。1.2.3样品处理和扫描电镜2006年夏季,在17∶00点左右采集尚未开放的小花,进行人工自花授粉后,1,2,3,4和5h各取样1次,然后将完整的柱头、花柱和子房一起剥离,材料置于卡诺固定液(酒精∶冰乙酸=3∶1),固定24h,70%酒精保存备用。蒸馏水冲洗数次。转入8mol/LNaOH溶液,在25℃过夜使组织软化,彻底冲洗去碱后,在0.1%苯胺蓝(0.1mol/LK3PO4,pH值12.4)中染色35min,缓冲液洗3或4次,共30min,1%锇酸再固定2h后用H3PO4缓冲液冲洗,30%,50%,70%,80%,90%和100%乙醇逐级脱水,每级15min,脱水后的样品放入醋酸异戊酯中置换过夜,在HCP-2型临界干燥器内进行干燥,用离子喷射仪真空喷金,在KYKY1000B-扫描电子显微镜下观察并照相。每处理观察计数10枚雌蕊。1.2.4自然传粉实当田间种植的‘广益’扁穗牛鞭草果穗成熟后,采回室内,统计开花总数和结实数(剥离检查),计算其自然传粉结实率:结实率(%)=结实数/开花数×100%。2结果2.1群体形态观察在光学显微镜下观察扁穗牛鞭草的花粉粒,粒大饱满的圆形花粉粒能够被I2-KI溶液染成黑色或深蓝色,表明其生活力较强。未着色的花粉粒呈金黄色,通常是小圆粒和瘪粒,瘪粒有多种形状,如椭圆形、三角形、不规则的多边形等。在扫描电子显微镜低放大倍数(400倍)下观察花粉粒群体形态,花粉粒为单粒,形态各有差异,有干瘪的畸形花粉粒存在(图1a)。正常的花粉粒通常呈球形或椭球形,具有较光滑的外壁纹饰,稍有起伏,个体大小近似。花粉粒近球形或扁球形,极面观(P)变幅25.9~38.2μm,赤道面(E)变幅24.12~34.71μm,平均大小(P×E)32.2μm×29.24μm。单孔(远极孔),孔明显,圆形或椭圆形,极面观变幅3.3~4.7μm,赤道面变幅2.3~3.8μm,萌发孔大小3.8μm×2.9μm,具孔环、孔帽,孔环内缘比较整齐,孔盖较小,形状不规则,孔盖表面为较大的颗粒状纹饰,孔环微外突。花粉粒表面为颗粒状纹饰,颗粒大小不等,粗糙,分布较均匀(图1b,c)。除部分干瘪畸形花粉粒外,‘广益’扁穗牛鞭草花粉形态、表面雕纹及萌发孔等,与其他禾本科植物花粉形态相似。2.2花粉活力与花粉粒活力从穗的顶部算起,第1节位小花记作第1朵小花。经调查统计,1枝完整的扁穗牛鞭草花序通常含小花33~43朵,平均为37朵,第1~33朵小花的平均花粉活力为29.96%,其中有柄小花花粉活力为29.72%,无柄小花花粉活力为30.21%。扁穗牛鞭草花粉活力以顶部最高,第1朵小花活力可以达到74.05%;向下活力开始降低,到中部的第16和第18朵小花达到最低,均低于8.00%;再向下活力开始上升,并趋近于平均活力(表1),这与吴彦奇和杜逸报道的“其基部第8或9小花以下的花粉粒全部无活力”有差别。该试验结果可能受扁穗牛鞭草种植年限、当年气候因素及花粉采集时期的影响,有关外界环境条件对花粉活力影响尚需要进一步研究。2.3自交不亲和性特征适宜环境条件下,花粉在柱头上萌发,然后长出花粉管插入柱头。授粉后1,2,3,4和5h,花粉萌发率随着花粉粒在柱头上停留时间的增长而提高。授粉1h后花粉萌发很快,3h后大量花粉管进入柱头表面的乳突细胞,花粉管生长无任何异常现象,4h后花粉萌发率超过60%,反映出授粉时间长短与花粉管萌发状况有一定的关联。但总趋势是花粉萌发率不高,授粉5h后发芽率仅为62.39%。随授粉时间延长,花粉管增长。但在授粉1h内花粉管增长速度最快,为14.1μm/h,以后的增长速度减缓,为1.3~3.9μm/h(表2)。以自花授粉材料观察花粉与柱头的相互识别情况,结果发现在自花授粉后,因相同基因型的花粉在柱头上表现出一定的不亲和现象,有的与乳突细胞接触不紧密,有的即使伸入柱头乳突细胞,花粉管几乎都有分叉、破裂(图1d),证明‘广益’扁穗牛鞭草存在自交不亲和性。另外还观察到,花粉在柱头上附着量很少,即使有花粉附着,花粉萌发迟,花粉管不伸入柱头乳突细胞,盘绕在柱头表面(图1e),或花粉管扭曲膨大(图1f),甚至呈萎缩状态。从观测结果看,广益‘扁穗牛鞭草自交不亲和主要表现为以下3种类型:1)花粉不能萌发;2)花粉能萌发,花粉管盘绕在柱头表面,不能进入;3)花粉能萌发,花粉管畸形或破裂,从而影响受精和结实。a:‘广益’扁穗牛鞭草畸形花粉粒萌发GerminationofabnormalpollenofH.compressa.b:‘广益’扁穗牛鞭草花粉粒的赤道面观Pollen’sequatorialviewofH.compressa.c:‘广益’扁穗牛鞭草花粉粒萌发孔Pollen’germinalapertureofH.compressa.d:花粉管进入乳突细胞,但尖端分叉Pollentubesenteringintopapillatebuttipsbursting.e:花粉萌发后盘绕在柱头表面Pollenbindingtoandtwingingonthesurfaceofstigmaaftergermination.f:花粉萌发后花粉管尖端膨大Pollengerminationbuttipsoftubesinflation2.4颖果的枝条形态对取回室内的4889枚成熟果穗进行剥离检查,共发现颖果57粒,其自然传粉结实率为1.17%。没有结成颖果的果穗几乎都可以发现枯萎的雌蕊,说明极低的结实率与生殖生理等因素有关,与颖果是否脱落等物理原因无关。扁穗牛鞭草进入结实期后,花序上、下部的颖果成熟时间极不一致,花序轴干脆易折,统计每个花位结实数目非常困难,给颖果的收集工作带来不便。3‘广益’排穗牛鞭草花粉的形态特征扁穗牛鞭草在长期的自然选择和人类不自觉的选择下,无性繁殖方式在生产上已被默认,以至延续至今,这可能是造成其结实率低的主要原因之一。由于其强大的横走根茎能够很快在地面长出新的植株,新的植株又能迅速向周围蔓延,在地上形成了严密的覆盖层,这就造成了扁穗牛鞭草产生的种子不易下土,即使下土后也很难长出新的植株。同时,利用这种高产优质牧草也是在持续放牧或适时刈割时,几乎不会等到其开花结实,这些都在无意识中加速了对其种子繁殖生殖方式的淘汰,使其更加适应于无性繁殖。Heslop-Harrison指出牧草花粉在结构和功能上具有不同程度的特异性,花粉是否具有育性及其活力的强弱都将可能影响结实的成败;并且花粉粒的形态特征符合遗传的稳定性和多样性规律,完全可以反映科、属、种间的一致性及差异。禾本科植物的花粉粒均为圆球形,单孔,颗粒状纹饰,而在种间存在着性状细节中的差异。花粉的演化趋势为舟形→纵长形(单沟)→球形→扁球形(具沟)→扁球形或圆球形→长球形。花粉的表面纹饰演化趋势为表面光滑→表面条纹状、网状→表面疣状、刺状等。依据上面的观点,从‘广益’扁穗牛鞭草花粉的外观形态、外表纹饰等特征推断,除干瘪粒以外,其花粉粒具有比较进化的外观特征,基本属于正常粒。此外,已萌发的花粉粒中也有干瘪现象出现,这可能是其自身遗传作用的结果,也可能是后天气候条件甚至是营养条件所致。电镜扫描观测研究结果表明,‘广益’扁穗牛鞭草自交不亲和与萌发的花粉管有许多异常现象有关。有研究认为提出自交不亲和是由S基因控制,但植物生殖过程是复杂的,‘广益’扁穗牛鞭草自交不亲和的遗传机制也是复杂多样的,可能存在2种或2种以上遗传机制同时在起作用,这需要进一步研究。关于花粉管在花柱中破裂的现象,与外界温度和花柱内不适合的渗透压有关,因而不能受精。在远缘杂交情况下,发生花粉管破裂更是常有的现象。在所有这些情况下,花粉管的破裂是一种生物学上不适应的表现,其后果是导致部分或完全的不孕。目前有大量文献表明花粉管破裂有其积极的生物学意义,花粉管泄出的内含物对雌蕊组织和正在发育的幼胚有深刻影响,并能促进相邻花粉萌发和生长。‘广益’扁穗牛鞭草不结实显然与花粉管的破裂有一定关系,但是尽管‘广益’扁穗牛鞭草结实率相当低,受精作用仍然可以成功完成,精核来源于自花还是异花尚需研究。另外,‘广益’扁穗牛鞭草花柱中生长的花粉管及其流出的内含物中,含有许多营养物质和生理活性物质,这些物质是积极参与雌蕊的代谢从而影响受精与胚胎发育,或仅是无谓的消耗,尚需用试验验证。花粉活力偏低也是造成扁穗牛鞭草结实困难的原因之一,并且不同花位花粉活力不同。位于花序顶部的小花花粉活力较高,可能是由于顶端优势,使其有充分的营养供应和时间来完成生理成熟,育性较高。而中部的小花在成花过程中既要面临上部小花开花对营养的需要,又要面对下部小花抽穗及成花对营养的争夺,所以育性普遍偏低。基部小花由于位于运输营养物质的花序轴基部,在营养的获得上明显更占有优势,所以其花粉生活力较中部小花有一定的提高。‘广益’扁穗牛鞭草花器官的正常发育、授粉和受精在其繁殖中是最重要也是关键的过程,对这些复杂生理过程的研究也显得迫切。因为它是生产上广泛使用的重要草种,其危机是它不能够产生正常的、能够发芽生根的种子,这就是为什么“花而不实”是‘广益’扁穗牛鞭草花粉研究中所面临的最大问题。在今后的研究中,对其“花而不实”机理进