膝沟藻毒素2和3的毛细管电泳法分析

膝沟藻毒素2和3的毛细管电泳法分析

海洋贝类素的出现与海洋环境密切相关。在发现的几种贝类毒素中，麻痹性贝类素（psp）是世界上最常见的。PSP是一类主要由赤潮藻类产生、带有胍基的三环氨基甲酸脂类酸稳定性小分子化合物。据报道,PSP是大亚湾海域及广东沿海中常见的贝类毒素,其中膝沟藻毒素(gonyautoxin,GTX)、neoSTX、C1和C2等均有在沿岸贝类和藻类中被发现的报道,GTX2和GTX3的毒性较强也较为常见。制备针对GTX2&3乃至针对大部分麻痹性贝毒的特异性抗体,是生产PSP快速检测试剂盒的关键。本文建立了GTX2&3高效毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)分析系统,对作为免疫原的GTX2&3样品进行了分析和定量,而GTX2&3的定量是这种半抗原与载体进行有效连接和相关特异性抗体筛选的必要条件。1材料和方法1.1适合我国树立的抗菌体质量所用仪器包括P/ACETMMDQ型高效毛细管电泳仪(BECKMANCOULTER,USA),紫外检测器,熔融石英毛细管(河北省永年锐沣光纤科技公司),Orion410A型精密pH计(USA)。麻痹性贝类毒素GTX2&3(NRC-CRM-GTX2&3-b)标准品购自加拿大国家研究院海洋研究所,免疫用GTX2&3样品赠自某国家重点实验室。其它化学试剂有:磷酸氢二钠和柠檬酸(汕头市光华化学厂,分析纯),36%醋酸(广州市海珠区化学试剂厂,分析纯),醋酸钠(广东光华化学厂,分析纯)。1.2有效长度和有效长度冲洗及运行缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。毛细管75μm×40cm,有效长度为30cm。分离电压6kv,温度25℃,压力进样(0.5psi,5s),紫外检测波长为200nm。1.3检测采用不同的pH值(分别为3.0,4.0,5.0,6.0)、不同的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液浓度(75,37.5,18.8mmol/L)、不同的分离电压(7,6,5kv),对NRC-CRM-GTX2&3-b标准GTX2&3毒素进行检测。1.4精密度、标准曲线及检出限采用37.5mmol/L,pH值为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为运行缓冲液,对GTX2浓度分别为118.0,59.0,29.5,14.6,5.6,1.3和0.5μmol/L;GTX3浓度分别为39.0,19.5,9.8,4.9,2.1,0.5和0.2μmol/L的NRC-CRM-GTX2&3-b进行检测,绘制峰面积-浓度标准曲线。并测定日内及日间检测精密度。用盐酸-醋酸溶液(3mmol/L盐酸,10mmol/L醋酸)按1∶10及1∶20的比例稀释GTX2&3免疫原,每个样品检测3次。NRC-CRM-GTX2&3-b(118.0μmol/L)和GTX2&3-b免疫原(1∶20稀释)按1∶1体积混匀,连续检测3次。2结果2.1在32kv时,电泳图谱的稳定性经不同pH值、不同运行缓冲液浓度和不同分离电压的测试,结果发现当磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液浓度为37.5mmol/L、pH值为5.0、分离电压为6kv时,电泳图谱的基线最为平整,噪音较低,两个峰的间隔较为适中(图1)。出峰时间为8.2~8.5min的峰为GTX2吸收峰,8.6~8.9min的峰是GTX3的吸收峰。在约11min处有一个醋酸根离子的负吸收峰。2.2方法的检测限和准确度对系列稀释浓度的NRC-CRM-GTX2&3-b标准品进行检测后,结果表明GTX2浓度在0.5~118.0μmol/L时,其峰面积与质量浓度之间有良好的线性关系,直线方程为Y=0.0004964X+0.081476,直线相关系数(r2)为0.9984,最低检测限为0.38μmol/L(按S/N=3计算);GTX3浓度在0.5~39.0μmol/L时,其峰面积与质量浓度之间有良好的线性关系,直线方程为Y=0.0004074+0.027997,直线相关系数(r2)为0.9986,最低检测限为0.36μmol/L(按S/N=3计算)。取NRC-CRM-GTX2&3-b标准品作两倍稀释,进行日内和日间的连续测定,测得日内精密度是:GTX2的浓度是58.7±1.5μmol/L,RSD为2.5%(n=12);GTX3的浓度是19.2±0.5μmol/L,RSD为2.6%(n=12)。日间精密度是:GTX2的浓度是58.5±3.3μmol/L,RSD为5.6%(n=8);GTX3的浓度是19.5±1.3μmol/L,RSD为6.3%(n=8)。2.3麻黄的n和8.9min峰面积在8.5~10min之间,GTX2&3免疫原有4个明显的吸收峰(图2a),将免疫原样品与NRC-CRM-GTX2&3-b标准品混匀后,8.5min和8.9min两个峰的峰面积明显增加(图2b),表明GTX2&3免疫原的这两个吸收峰与NRC-CRM-GTX2&3-b标准品的GTX2与GTX3的两个吸收峰发生了叠加。根据8.5min的峰面积及GTX2标准曲线,计算出GTX2&3免疫原中GTX2的浓度为325.8±32.8μmol/L(n=3);依据8.9min的峰面积及GTX3标准曲线,计算出GTX2&3免疫原中GTX3的浓度为287.6±15.1μmol/L(n=3)。3检测限和定量限Thibault等建立的GTX2&3CE检测系统中使用的吗啉价格较贵,本文首次利用价格便宜的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲系统作为CE运行缓冲液来检测GTX2&3,获得了较低的检测限(GTX20.38μmol/L,GTX30.36μmol/L)和较为满意的线性检测范围。这个检测方法的建立,不但使作为免疫原的GTX2&3样品得到较好的定量,而且也极有可能应用于海产品中污染GTX2&3的定性和定量检测。本文所使用的GTX2&3免