大二学习微生物学第7章病毒

第七章病毒杨继红华中师范大学生物学实验教学示范中心CentralChinaNormalUniversityTeachingCentreforBiologicalExiperiment第一节概述

在10例接种过的植物中，有1例成功地使健康植物……成功染病。MayerA.LandwnVerSStnen1886;32:451-467.

可溶解的、或许像酶一样的接触传染病菌，尽管对这种假设的几乎任何类推都没有科学依据。MayerA.TijdschrLandbouwk1882;2:359-364.

受烟草花叶病感染的叶子的汁液即使用张伯伦滤器过滤之后还是保留了它的感染性。IvanofskyD.PetersburgAcadImpSciBull1892;35:67-70

使用的张伯伦滤器有缺陷；方法错误；可能是一种毒素。IvanofskyD.Zeit.Pfanzenkr1903，13:1-41

受感染的烟草汁液用张伯伦滤器过滤之后可保留了它的感染性；

病原体可以在生长的植物活组织内繁殖；病原体是传染性活的汁液（“contagiumvivumfluidum”,acontagiouslivingfluid）BeijerinckMW.VerhAkadWetensch,Amsterdam,II1898;6:3-21AdolfMayerDmitriiIwanowskiMartinusBeijerinck烟草花叶病1886年德国农艺师AdolfMayer发现烟草花叶病：1892年俄国人D.Ivanovsky发现烟草花叶病病原的滤过性张伯伦滤器1898年荷兰人MWBeijerinck认为烟草花叶病病原是一种新的具有传染性的物质，并将其命名为病毒。健康烟草一、病毒的特点和定义病毒为具有独立于其宿主的进化史的绝对细胞内寄生物，它的DNA或RNA基因组被其所编码的蛋白质壳体化（encapsidation）。……Fields等，1990年结构简单，无细胞结构；只有一种核酸：DNA或RNA；无完整酶系统和能量系统；以复制方式进行繁殖；严格的活细胞内寄生。1.病毒的定义2.病毒的特点1.病毒的定义病毒是严格寄生于细胞内并可使寄主致病的活体，它只有一种核酸，以其遗传物质的形式增殖，不能生长发育和进行双分裂，没有产生能量的酶系统。病毒是遗传物质的单元，在它们进行繁殖的细胞内，能够生物合成专一性结构，以使它们自己转移到其它细胞中去。病毒是一种生物，其基因组是由核酸（或为DNA，或为RNA）组成，它们在活细胞内复制，并利用活细胞的合成机器来合成特殊的质粒，即病毒粒子。它包含病毒基因组，并把病毒基因组转移到其它的细胞中去。Lwoff（1957）Luria（1959）Luria&Darnell（1968）尚无科学而严谨的定义（真）病毒：至少含核酸和蛋白质二种组分（真）病毒：至少含核酸和蛋白质二种组分类病毒：只含具侵染性的RNA组分卫星病毒：卫星RNA：朊病毒：只有蛋白质没有核酸病毒是具有生命主要特征且能自我装配的遗传单位。狭义概念广义概念高尚荫院士的病毒定义2.病毒的特点单细胞微生物与病毒性质的比较病毒生命形式的两重性在细胞外时，病毒不表现复制活性，但保持感染活性；在细胞内则解体释放出核酸分子（DNA或RNA），借细胞内环境的条件以独特的生命活动体系进行复制。体外纯化病毒具有化学大分子属性，可像化学分子一样结晶，即化学结晶型，在细胞内具有生物体基本特征，即生命活动型。在细胞外病毒虽具感染性但以病毒粒子方式，即其颗粒形式；一旦感染细胞进入细胞内，病毒即解体而释放出核酸基因组进行复制和增殖，而无病毒粒子存在，是为其基因形式。胞外形式与胞内形式化学结晶型和生命活动型颗粒形式与基因形式二、病毒的宿主范围病毒动物病毒植物病毒噬菌体原生动物病毒无脊椎动物病毒脊椎动物病毒真菌病毒噬藻体植物病毒细菌噬菌体古菌噬菌体螺旋体噬菌体支原体噬菌体噬蓝藻体医学病毒兽医病毒昆虫病毒也称病毒的宿主谱，是指病毒能够感染并在其中复制的宿主种类和组织细胞种类。病毒的宿主范围有些病毒有较宽的宿主谱虫媒病毒（arboviruses）既能够在吸血的蚊、蠓、蜱、螨等节肢动物中繁殖，又作为媒介在哺乳类和禽类等脊椎动物中广泛传播。虫媒病毒三、病毒的分类命名1.病毒分类原则稳定性是指病毒名称及其隶属关系一旦确定下来，就应该尽可能的保留。稳定性实用性是指病毒分类体制应该对病毒学研究领域是有用的。实用性认可性是指病毒分类阶元和名称应该为病毒学研究者乐意接受和使用。认可性灵活性是指病毒分类阶元可以依据某些新发现而进行重新修订和再确定。灵活性2.病毒分类依据形态：如大小、形状、包膜和包膜突起的有无，衣壳结构及其对称性；理化性质：如分子量，沉降系数，浮力密度，病毒粒子在不同pH、温度、Mg2+、Mn2+、变性剂、辐射中的稳定性；基因组：如基因组大小、核酸类型、单双链、线状或环状，正负链，G+C所占的比例、核苷酸序列等；

蛋白：如结构和非结构蛋白数量、大小、功能和活性，氨基酸序列等；病毒脂类含量和特性；碳水化合物含量和特性；病毒基因组组成和复制。病毒天然的宿主范围；病毒在自然状态下的传播与媒介体的关系；病毒的地理分布，致病机理，组织嗜亲性；病毒引起的病理和组织病理学特点。血清学性质病毒毒粒的特性生物学性质3.病毒命名规则国际病毒分类系统采用目（order）、科(family)、亚科(subfamily)、属(genus)、种(species)为分类等级，在未设立病毒目的情况下，科则为最高的病毒分类等级。ICTV不负责病毒种以下的分类和命名，病毒种以下的血清型、基因型、毒力株、变异株和分离株的名称由公认的国际专家小组确定。人工产生的病毒和实验室构建的杂种病毒在病毒分类上不予考虑，它们的分类由公认的国际专家小组负责。病毒分类命名一般规则分类等级的命名规则病毒种是指构成一个复制谱系(replicatinglineage)，占据一个特定小生境（ecologicalniche），具有多原则分类(polytheticclass)特性（如基因组、独立结构、理化特性和血清学性质的病毒；种名由少数几个有实际意义的词组成，但不应该只是由宿主名加“virus”构成，必须赋予种恰如其分的鉴别特征。病毒属是一群具有某些共同特性的种；属名的词尾是“…virus”；一个承认的新属必须有一个同时被承认代表种(typespecies)。病毒科是一群具有某些共同特征的属（无论这些属是否构成亚科）；科名的词尾是“…viridae”；如有必要科与属之间可设立亚科，亚科名的词尾是“…virinae”。病毒目是一群具有某些共同特征的科；目名的词尾是“…virales”。种的分类命名规则种的分类命名规则科的分类命名规则目的分类命名规则3.病毒命名规则病毒分类规则适用于类病毒（viroids）分类，种的词尾是“viroid”，属的词尾为“-viroid”，亚科的词尾是“-viroinae”，科的词尾是“-viroidae”。卫星病毒和朊病毒不按病毒分类规则分类，采用任意分类，不设立科与属。病毒目、科、亚科、属的接受名（acceptedname）和种名一律用斜体打印，名称的第一个字母要大写；分类名称应放在分类等级术语前；如…Reovirideae(科)，…Phytoreovirus(属),…woundtumorvirus（种）等。亚病毒的分类命名规则病毒名称的书写规则ICTV病毒分类第八次报告2005年7月国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）发布病毒分类第八次报告，将目前ICTV所承认的5450多个病毒归属为3个目、73个科、11个亚科、289个属、1950多个种。在亚病毒感染因子下设类病毒、卫星病毒、卫星RNA和朊毒，其中：类病毒有2个科、7个属；卫星病毒有2个亚组；卫星核酸有3个亚组；朊毒分为哺乳动物朊毒和真菌朊毒。第二节病毒研究的基本方法一、病毒的分离病毒的分离是将疑有病毒感染的材料（如微生物发酵生产的倒灌液，疑似病毒感染的植物材料，疑似病毒感染患者的体液、血液、分辨等临床标本）经处理后，接种于敏感的实验宿主、鸡胚或细胞培养物，经过一段时间培养来获得病毒培养物。选择合适的标本种类确定最适采集时间恰当的运送储存条件避免细菌污染：加抗生素、离心除菌和过滤除菌释放病毒：细胞冻融、研磨破碎或超声破碎加入病毒保护剂病毒分离标本采集标本处理1.噬菌体分离培养疑似噬菌体感染的标本细菌液体培养物细菌固体培养物培养液变清澈形成残缺平板1.噬菌体分离培养噬菌体标本经适当稀释后接种至细菌平板，经过一段时间培养，在细菌菌苔上形成圆形局部透明区，及噬菌斑。噬菌斑噬菌斑2.动物病毒分离培养嗜神经的病毒脑内接种嗜呼吸道的病毒病毒鼻腔接种嗜皮肤的病毒皮下、皮内接种嗜呼吸道病毒鸡胚尿囊腔或者羊膜腔接种嗜皮肤的病毒鸡胚绒毛膜接种没有特异性抗体和非特异性病毒抑制物干扰培养接种方法简单条件易于控制成本相对低廉动物培养鸡胚培养细胞培养的优点鸡胚接种方法羊膜腔羊膜腔接种绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜卵黄囊卵黄囊接种鸡胚接种尿囊腔卵白卵壳气室尿囊腔接种病毒在绒毛膜上的蚀斑细胞病变效应病毒感染引起细胞产生显著的形态改变，如聚集成团、肿大、圆缩、脱落、细胞融合、形成包涵体（inclusionbody）、细胞裂解等，称为细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE）。细胞病变效应包涵体（inclusionbody）包涵体（inclusionbody）是指在病毒感染敏感细胞内出现的一种不正常着色的单个或多个大小不等的圆形或不规则形状的嗜酸性或嗜碱性小体。包涵体空斑（plaque）经过适当稀释的标本进行接种至贴壁细胞，在单层细胞上覆以营养琼脂培养基，病毒感染被限制临近的细胞，再辅以适当染色，如中性红染色，未感染活细胞显红色，病毒感染细胞死亡不着色，形成肉眼可见的局部病损区域，称为蚀斑（plaque）或称空斑。空斑（plaque）3.植物病毒分离培养在健康敏感植物上选取已经展开健康生长的正常叶片；在叶片正面洒上金刚砂；左手托叶背，右手食指沾取样品液在叶片上往返摩擦接种。用毛笔取无毒蚜虫50-100头，放在干燥培养皿内饥饿2hr；将饥饿蚜虫转移到病毒感染植株上，饲毒24hr；将饲毒后的蚜虫转移到健康敏感植物上，饲食24hr接种病毒摩擦接种蚜虫传毒枯斑经过适当稀释的标本进行接种至健康敏感植物叶片后，病毒感染被限制在接种区域附近区域，病毒感染的植物细胞死亡，形成肉眼可见的局部褪绿、枯黄病损区域，称为枯斑。枯斑二、病毒的纯化病毒的纯化就是利用物理、化学和其他一切可能的方法将病毒培养物中混杂的组织/细胞成分、培养基成分、可能污染的微生物及其它杂质成分除去，获得纯净的病毒。纯化的病毒制备物应保持感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性：毒粒大小、形态、密度、化学组成及抗原性质应当具有均一性。病毒主要成分为蛋白质：蛋白质提纯方法如盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等均可用于病毒纯化。毒粒具有一定的大小、形状和密度：离心技术1.病毒纯化2.纯化标准3.纯化方法梯度离心差速离心三、病毒数量测定电子显微镜计数血凝试验定量免疫沉淀实验定量酶联免疫实验定量分光光度计法定量荧光定量PCR定量1.病毒物理颗粒计数能够引起宿主或细胞一定特异性感染反应的病毒剂量，称为感染单位（infectiousunit，IU）。2.感染单位单位体积中待测样品病毒的感染单位数量表示（IU/mL），称做病毒的效价或滴度（titer）。3.病毒效价4.噬（蚀）斑测定1.取一定量的经系列稀释的噬菌体悬液与高浓度的敏感细菌悬液和半固体营养琼脂均匀混合2.涂布在已铺有较高浓度的营养琼脂的平板上3.经过一定时间孵育4.被半固体营养琼脂限制的噬菌体裂解敏感细菌，在平板上连成片的菌苔中形成单个分散的噬菌斑病毒噬（蚀）斑测定试验中在单层细胞上形成一个噬（蚀）斑的病毒量，称作一个空斑形成单位（plaqueforminunit，PFU）噬斑形成单位4.噬（蚀）斑测定空斑测定：裂解细胞的病毒合胞体技术：引起细胞融合的病毒转化灶测定：引起细胞转化的病毒血球吸附斑测定：具有血凝能力的病毒动物病毒空斑形成单位以病毒感染产生的坏死斑来测定植物病毒枯斑形成单位5.半数效应剂量取等体积的经系列稀释病毒悬液分别接种同样的实验单元（如某种动物、植物、鸡胚或细胞），经过一段时间孵育后，以实验单元群体中的半数（50%）个体出现某一感染反应所需要的病毒量，称作半数效应剂量，以出现50%感染的实验单元接受的病毒悬液的稀释度的倒数的对数值表示。半数效应剂量LD50、ID50和TCID50使半数实验宿主发生死亡的病毒剂量，称作半数致死剂量（50%lethaldose，LD50）。使半数实验宿主发生感染的病毒剂量，称作半数感染剂量（50%infectivedose，ID50）使半数组织培养物发生感染的病毒剂量，称作半数组织培养感染剂量（50%tissuecultureinfectivedose，TCID50）半数致死剂量半数感染剂量半数组织培养感染剂量四、病毒的鉴定免疫沉淀血凝和血凝抑制试验酶联免疫吸附实验中和实验免疫荧光放射免疫蛋白质电泳核酸酶切图谱分子杂交序列测定聚合酶链反应4.血清学性质5.分子鉴定宿主的疾病症状在鸡胚上的特征反应细胞病变效应电镜下形态大小浮力密度沉降系数理化因子抗性2.感染表现3.理化性质鉴定病毒可以感染的宿主种类1.宿主谱第三节毒粒的性质毒粒（virion）又称为病毒粒子、病毒颗粒，是指完整的具有感染性病毒的细胞外颗粒形式，也是病毒的感染性形式。毒粒（virion）是一团能够自主复制的遗传物质（DNA或RNA），被自身编码的蛋白质外壳包裹，有些还具有包膜，以保护其遗传物质免遭环境破坏，并将遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞。毒粒（virion）Dulbecco（1985）一、病毒的形态结构1.病毒的大小红细胞（直径10µm）T4噬菌体（长225nm）腺病毒（直径90nm）f2、MS2噬菌体（直径90nm）M13噬菌体（800*10nm）TMV（250*18nm）脊髓灰质炎病毒（30nm）痘病毒（300*200*100nm）大肠杆菌（3000*1000nm）衣原体（1500*250nm）质膜厚度（10nm）最大和最小的病毒2.病毒的形态2.病毒的形态球形杆状丝状砖形子弹状蝌蚪状3.壳体的结构壳体（capsid）是由大量相同客体蛋白单体分子（即蛋白质亚基）通过次级键结合按一定的对称形式有规律地排列而成的包围着病毒核酸及结合蛋白的蛋白质外壳，是病毒毒粒的基本结构。廿面体对称双对称螺旋对称壳体（capsid）螺旋对称壳体蛋白质亚基有规律地沿着中心轴呈螺旋排列，进而形成高度有序、对称的稳定结构。蛋白质亚基总数螺旋长度螺旋直径轴孔直径螺距螺转数每一螺转蛋白亚基数目螺旋对称壳体烟草花叶病毒（TMV）蛋白质亚基总数：2130螺旋长度：300nm螺旋直径：15nm轴孔直径螺距：2.3nm螺转数：130圈每一螺转蛋白亚基数目：16.38二十面体对称壳体蛋白质亚基围绕具立方对称的正二十面体的角或边排列，进而形成一个封闭的蛋白质的鞘。二十面体对称壳体二十面体：十二个顶点，20个面，三十条边。腺病毒与SV40腺病毒由1500个蛋白质亚基形成252个壳粒围绕具立方对称的的角或边排列形成一个封闭的正二十面体蛋白质鞘。腺病毒五邻体：12个，位于二十面体的顶点六邻体：240个，位于二十面体的便和面上SV40由360个蛋白质亚基形成72个中心凹陷的圆筒状五邻体壳粒围绕具立方对称的角或边排列形成封闭的正二十面体蛋白质鞘。猴病毒40二十面体的顶点12个五邻体，与5个五邻体相邻；60个非顶点五邻体与6个五邻体相邻。壳粒、五邻体与六邻体在病毒二十面体壳体构成中，一定数量的蛋白质亚基以特殊方式聚集形成的在电镜下可见的形态学单位（morphologicalunit）叫做壳粒（capsome）。壳粒由5个蛋白质亚基以特殊方式聚集形成的在电镜下可见的形态学单位（morphologicalunit）叫做五邻体（penton）或五聚体（pentamers）。五邻体由6个蛋白质亚基以特殊方式聚集形成的在电镜下可见的形态学单位（morphologicalunit）叫做六邻体（hexon）或六聚体（hexamers）。六邻体双对称结构有尾噬菌体（tailedphage），其壳体由头部和尾部组成。包装有病毒核酸的头部通常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。二十面体对称壳体头颈尾基片尾丝尾针4.核壳核壳（nucleocapsid）是由病毒蛋白质形成的壳体包裹病毒核心）构成的复合结构。核壳病毒核酸结合蛋白毒粒酶病毒核心5.包膜一些复杂病毒的核壳外包裹着的一层在病毒以出芽方式成熟时由宿主细胞膜衍生而来的脂蛋白膜，叫做包膜（envelop）。包膜结构包膜结构域生物膜结构相似，为脂质双分子层。脂类：来源于宿主细胞膜蛋白质：病毒基因编码，称作包膜蛋白组成跨膜区：以跨膜固着肽结合在脂质双分子层膜外区：主要结构，在膜外形成包膜突起（peplomer）膜内区：较小的结构域包膜蛋白包膜的形成病毒核壳病毒糖蛋白病毒基质蛋白6.刺突由病毒蛋白质形成的伸出病毒毒粒外的钉状突起物，叫做刺突（spike）。刺突病毒四种主要结构类型裸露的二十面体毒粒裸露的螺旋对称毒粒有包膜的螺旋对称毒粒有包膜的二十面体毒粒复杂病毒有尾噬菌体痘病毒二、毒粒的化学组成毒粒（化学组成）核酸基本化学组成病毒颗粒在化学上表现为核蛋白碳水化合物蛋白质脂类其它成分1.病毒的核酸单链DNA（ssDNA）线性单链DNA环状单链DNA线性双链DNA线性双链但其中一条链不连续线性双链，末端交联双链闭合环状双链DNA（dsDNA）单链RNA（ssRNA）双链RNA（dsRNA）双链闭合环状线性单链负链线性单链正链线性单链正链二倍体线性单链负链分段线性双链分段单链核酸的极性有某些病毒的RNA是双意（ambisense），即部分为正极性、部分为负极性。线性双链DNA的环化2.病毒的蛋白质结构蛋白（structureprotein）是指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质。结构蛋白非结构蛋白非结构蛋白（nonstructureprotein）是指由病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中的蛋白质。构成蛋白质外壳决定病毒感染的特异性决定病毒的抗原性构成毒粒酶：功能结构蛋白壳体蛋白（capsidprotein）是指病毒壳体的蛋白质由一条或多条多肽链折叠成蛋白亚基是构成壳体的最小单位病毒壳体可由一种或多种壳体蛋白组成壳体蛋白糖蛋白：包膜糖蛋白通过β-N-糖苷键将N-乙酰葡萄糖胺与肽链的天冬酰胺残基连接，有些通过O-糖苷键与丝氨酸或苏氨酸残基连接基质蛋白：构成包膜脂质双分子层与核壳之间的亚膜结构包膜蛋白侵入酶：T4噬菌体溶菌酶，流感病毒神经氨酸酶聚合酶：逆转录酶、依赖RNA的RNA聚合酶、依赖DNA的RNA聚合酶毒粒酶其它第三节病毒的复制病毒感染敏感宿主细胞后，进入细胞释放出病毒核酸，通过其复制产生子代病毒基因组，表达产生蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分自我装配（self-assembly）成子代病毒粒子，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做病毒的复制（replication）。病毒的复制一、一步生长曲线用适量的病毒接种处于标准培养的高浓度的敏感宿主细胞，病毒吸附后，通过加入抗病毒血清处理（中和未吸附的噬菌体）或高倍稀释病毒-细胞培养物建立病毒同步感染，定时取样检测培养物中的病毒效价（对噬菌体含量进行计数），以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出的病毒特征性繁殖曲线，称为病毒的一步生长曲线（one-stepgrowthcurve）。一步生长曲线病毒的量包括未吸附的病毒和新释放的病毒将培养物过滤去细胞后测定病毒数量游离病毒细胞内的病毒离心沉淀细胞，将细胞裂解后测定病毒数量胞内病毒包括未吸附的病毒、感染细胞和新释放的病毒取培养物直接测定病毒数量全部病毒病毒复制的三个阶段游离的噬菌体吸附到宿主细胞。吸附期从病毒吸附于细胞到受感染的细胞释放出子代病毒粒子所需的最短时期。潜伏期随着病毒复制，宿主细胞裂解，子代病毒粒子大量释放，数目指数级增加。裂解期细菌病毒：以分钟计动物病毒：以小时或天计植物病毒：以小时或天计病毒的潜伏期潜伏期受染细胞内子代病毒核酸和蛋白质大量合成，但检测不到感染性病毒隐蔽期受染细胞内子代病毒核酸和蛋白质自我装配成子代病毒，感染性病毒在受染细胞内的数量急剧增加成熟期不同病毒的隐蔽期长短不同，例如，DNA动物病毒的隐蔽期为5～20小时，RNA动物病毒为2～10小时。隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线呈线性函数，而非指数关系，从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因组与蛋白质经装配成熟，而不是通过双分裂方式产生的。裂解量裂解量是指每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目，其值等于稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目除以潜伏期受染细胞的数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。裂解量噬菌体：一般为几十到上百个植物病毒：可达数百乃至上万个动物病毒：可达数百乃至上万个不同病毒的裂解量二、病毒的复制周期复制周期（replicativecircle）又称复制循环，是指自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程，包括病毒吸附、侵入、脱壳、复制与表达、病毒装配与释放等六个阶段病毒复制周期1.病毒吸附吸附是指病毒表面吸附蛋白与宿主细胞病毒受体特异性结合，导致病毒粘附于宿主细胞表面的过程。病毒吸附1.病毒吸附病毒粒子敏感细胞可逆吸附，无特异性（非细胞颗粒也可吸附）特异性，不可逆吸附启动病毒感染的第一阶段随机碰撞而接触（静电引力或氢键）通过病毒吸附蛋白与细胞受体的结合（1）病毒吸附病毒吸附蛋白是病毒毒粒表面能够特异性地识别细胞表面受体并与之接合的结构蛋白分子。无囊膜病毒的病毒结合蛋白是病毒壳体蛋白，有囊膜病毒的病毒结合蛋白是其囊膜蛋白。病毒吸附蛋白（2）病毒受体病毒受体，是指能被病毒吸附蛋白特异性识别并与之结合，接到病毒进入细胞，启动病毒感染发生的一组细胞膜表面分子。大多数为蛋白质，也可能是糖蛋白或磷脂。病毒受体病毒吸附蛋白与细胞的病毒受体间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力。2.病毒侵入侵入又称病毒内化（internalization），它是一个病毒吸附后几乎立即发生，依赖于能量的感染步骤。的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同。病毒侵入（1）尾噬菌体-注射式侵入着陆尾钉固着尾鞘收缩尾管穿入DNA注入噬菌体通过尾丝在细菌细胞壁着陆噬菌体通过尾刺固着于细胞噬菌体通过尾丝在细菌细胞壁着陆噬菌体通过溶菌酶裂解细胞壁穿孔噬菌体头部收缩从穿孔将DNA注入细胞内如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔，也可引起细胞立即裂解，但并未进行噬菌体的增殖，这种现象称为自外裂解（lysisfromwithout）。自外裂解（2）动物病毒膜移位膜融合内吞作用（3）植物病毒微伤侵入媒介昆虫胞间连丝通过因人为地或自然的机械损伤所形成的微伤口进入植物细胞；通过携带有病毒的媒介有吮吸式口器的昆虫取食时将病毒带入植物细胞。进入细胞的植物病毒增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运动蛋白（movementprotein）与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞。植物病毒通过胞间连丝传递3.脱壳脱壳脱壳是病毒侵入后，病毒的包膜和/或壳体除去而释放出病毒核酸的过程。4.基因组复制与蛋白质合成T4噬菌体基因组复制与蛋白质合成生命科学学院微生物学教研室－YJHT4噬菌体基因组复制与蛋白质合成5.装配装配新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒，称做病毒的装配，亦称成熟（maturation）或形态发生（morphogenesis）。（1）T4噬菌体装配（2）烟草花叶病毒装配（2）烟草花叶病毒装配6.释放裂解细胞膜分泌出芽出芽第四节病毒的非增殖性感染增殖性感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞内，并能产生感染性子代病毒粒子的病毒感染，叫做增殖性感染（productiveinfection）。非增殖性感染由于病毒或细胞的原因，致使病毒进入敏感细胞后的病毒的复制在某一阶段受阻，导致病毒感染的不完全循环，虽因病毒与细胞的相互作用，亦可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内不产生有感染性的子代病毒病毒粒子的病毒感染，叫做非增殖性感染（productiveinfection）。一、非增殖性感染的类型1.流产感染（1）非允许细胞：如果病毒的细胞是非允许细胞，则病毒不能复制。2.限制性感染病毒因细胞的瞬时允许性发生，造成病毒持续存在于感染细胞内，或群体中仅有少数细胞产生子代病毒病毒粒子（2）缺损病毒：如果感染细胞的病毒是缺损病毒，其基因组有缺损，丧失某些功能，导致病毒不能完成复制循环。3.潜伏感染感染细胞内有病毒病毒基因组长期存在，但并无感染性病毒粒子产生二、缺损病毒1.缺损干扰颗粒

缺损干扰颗粒（defectiveparticle，DI颗粒）是病毒复制时产生的一类亚基因组的缺失突变体。2.卫星病毒卫星病毒（satellitevirus）是一类基因组缺损、需要依赖辅助病毒，基因才能复制和表达，才能完成增殖的亚病毒，不单独存在，常伴随着其他病毒一起出现。3.条件缺损病毒条件缺损病毒是一类基因组发生了突变的病毒条件致死体，他们能在允许条件下复制，但在非允许条件下不能完成复制循环。3.整合病毒基因组病毒感染宿主细胞后，基因组整合于宿主细胞染色体上，并随细胞分裂传递到子代细胞中（1）温和噬菌体烈性噬菌体（virulentphage）：感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环（lyticcycle）的噬菌体。温和噬菌体或称溶源性噬菌体（lysogenicphage）：感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生的噬菌体。这一现象称做溶源性（lysogeny）现象在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中（如λ噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在（如P1噬菌体）。温和噬菌体的溶源性反应整合于细菌染色体或以质粒形成存在的温和噬菌体基因组称做原噬菌体（prophage）在原噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称做溶源性细菌（lysogenicbacteria）溶源性细菌经自发裂解或诱发裂解，进入裂解循环。生命科学学院微生物学教研室－YJH2、溶源性感染对细胞的影响溶源菌中温和噬菌体基因组通常不影响细胞的繁殖功能，但它们可能引起其他的细胞变化。（1）免疫性被温和噬菌体感染后形成的溶源性细菌具有“免疫性”，即其它同类噬菌体虽然可以再次感染该细胞，但不能增殖，也不能导致溶源性细菌裂解。免疫性是由原噬菌体产生的阻遏蛋白的可扩散性质所决定的。生命科学学院微生物学教研室－YJH2、溶源性感染对细胞的影响（1）溶源转变溶源性细菌有时还能获得一些新的生理特性，例如白喉杆菌只有在含有特定类型的原噬菌体时才能产生白喉毒素，引起被感染机体发病。原噬菌体引起的溶源性细菌除免疫性外的其他的表形改变，包括溶源菌细胞表面性质的改变和致病性转变被称为溶源转变（lysogenicconversion）。λ噬菌体的的溶源性反应进入宿主后线状基因组依靠粘性末端环化λ噬菌体的的溶源性反应基因组的表达与复制存在着强烈的时序性λ噬菌体的的溶源性反应早期基因表达，产生gpcII，gpcro及gpcIII，后者可防止宿主的裂解酶对gpcII的降解。gpcII的积累促使阻遏蛋白cI的表达阻遏蛋白cI的积累导致噬菌体基因转录的终止，形成原噬菌体。早期表达的gpcro与cI的竞争最终确定λ噬菌体是进入溶源状态，还是进入裂解循环。（gpcro表达得早，但与基因组的结合能力较cI弱）阻遏蛋白cI在一般情况下通过自身的转录激活保持低水平的表达，但有时种种原因转录水平下降，会偶尔导致溶源性噬菌体进入裂解循环（10-5~10-2）。阻遏蛋白cI的同样可以抑制其它新侵入的λ噬菌体的表达，从而使溶源性细菌具有“免疫性”λ噬菌体的的溶源性反应通过特定位点整合（切离）细菌染色体诱发裂解外界因素如紫外线可引起宿主的染色体的破坏，宿主产生应急反应合成具有DNA重组活性的RecA蛋白，导致cI的被降解，噬菌体进入裂解循环。诱发裂解是检查是否存在溶原性细菌的有效方法第五节亚病毒因子一、卫星病毒（satellitevirus）

卫星病毒（satellitevirus）是一类基因组缺损、需要依赖辅助病毒，基因才能复制和表达，才能完成增殖的亚病毒。如大肠肝菌噬菌体P4，缺乏编码衣壳蛋白的基因，需辅助病毒大肠杆菌噬菌体P2同时感染，且依赖P2合成的壳体蛋白装配成含P2壳体1／3左右的P4壳体，与较小的P4DNA组装成完整的P4颗粒，完成增殖过程。丁型肝炎病毒(HDV)必须利用乙型肝炎病毒的包膜蛋白才能完成复制周期。常见的卫星病毒还有腺联病毒(AAV)、卫星烟草花叶病毒(STMV)、卫星玉米白线花叶病毒(SMWLMV)、卫星稷子花叶病(SPMV)等。

二、卫星RNA卫星RNA是指一些必须依赖辅助病毒进行复制的小分子单链RNA片段，他们被包裹在辅助病毒粒子中，本身对与辅助病毒的复制不是必需的，且它们与辅助病毒的基因组无明显的同源性。1.基因组结构根据大小卫星RNA可分为两类：大者长度1372-1376个核苷酸，大小与卫星病毒基因组相似；如番茄黑环病毒的卫星RNA。大多数大小在300个核苷酸。如烟草环斑病毒、黄瓜花叶病毒的卫星RNA。许多卫星RNA的5’端有帽子结构，3’端无poly（A）结构，而是类似tRNA结构，而且卫星RNA分子内部碱基配对形成复杂的二级结构。较大的卫星RNA具有开放阅读框并能够表达，较小的卫星RNA似乎不具有mRNA的功能。许多卫星RNA能以线状和环状两种形式存在于被感染的组织内，但在辅助病毒中只以线状形式存在。2.卫星RNA的复制较小的卫星RNA以对称的滚环方式复制。复制产生的正链和负链多聚体经自我切割产生线状的单体分子；线状的负链RNA环化后作为合成子代正链的模板。较大的卫星RNA复制时不能自我切割，复制方式与其辅助病毒一致。3.卫星RNA的生物活性许多卫星RNA能显著影响其辅助病毒在宿主中产生的症状：南芥菜花叶病毒卫星RNA能加重南芥菜花叶病毒所引起的花叶和腿绿症状。番茄黑环病毒的卫星RNA能够明显减轻番茄黑环病毒在烟草上引起的症状。三、类病毒类病毒是无蛋白质外壳保护的游离的共价闭合环状单链RNA分子，侵入宿主细胞后自我复制，并使宿主致病或死亡。仅含330～380核苷酸。最先是由T.O.Diener等人（1969）在马铃薯纤块茎病（potatospindletuberdisease）的病株上首先发现的，在电镜下可见到这RNA分子呈50nm长的杆状分子，共有359个碱基对，并证实是游离的RNA，为此正式命名为类病毒。1.类病毒的结构特征位于棒状结构中心有一个高度保守的序列；靠近这一保守中心区的左侧有一个多聚嘌呤区；棒状结构左侧序列保守性强，右侧变异性大。它可能是通过核苷酸序列或结构改变直接与寄主细胞相互作用、干扰细胞的代谢而致病。2.类病毒的复制类病毒没有编码功能，其复制完全利用宿主细胞酶，涉及细胞的RNA聚合酶II。类病毒以对称或非对称的滚环机制复制。鳄梨日斑类病毒以对称滚环复制方式复制；马铃薯纺锤形块茎类病毒以非对称滚环复制方式复制，即由滚环复制产生的多聚体负链RNA直接产生多聚体正链RNA，然后自我剪切环化形成子代类病毒。对称或非对称的滚环机制3.类病毒的理化特性类病毒能耐受紫外线和作用于蛋白质的各种理化因素，比如对蛋白酶，胰蛋白酶，尿素等都不敏感（“真病毒”均敏感），在90℃下仍能存活（“真病毒”在50～60℃下失活）。4.类病毒的传播类病毒现在仅在高等植物中发现，一般通过接触，擦伤，节肢动物和菟丝子传播。类病毒在传播方式上明显不同于“真病毒”的是可以通过花粉和种子垂直传播。5.类病毒引起的疾病迄今已发现的类病毒已有18种，其中多为植物类病毒。植物类病毒能引发多种疾病：番茄簇顶病柑桔裂皮病黄瓜白果病椰子死亡病等。防治的方法主要选择无感的种子和繁殖体，以及防止机械传播。5.类病毒引起的疾病Fig.2:SymptomsofviroiddiseasesA:potatospindletuberontomatoB:avocadosunblotchC:chrysanthemumstuntDchrysanthemumchloroticmottle四、朊病毒朊病毒又称蛋白质侵染因子，是一类能侵染哺乳动物亚急性海绵样脑病的无免疫性疏水蛋白质致病因子。“朊病毒”最早是由美国加州大学Prusiner等1982年提出。生命科学学院微生物学教研室－YJH1.朊病毒的形态朊病毒大小只有30-50纳米，电镜下见不到病毒粒子的结构；经负染后才见到聚集而成的棒状体，其大小约为10-250x100-200纳米。2.朊病毒的理化特性朊病毒对多种因素的灭活作用表现出惊人的抗性。对物理因素，如紫外线照射、电离辐射、超声波以及80～100℃高温，均有相当的耐受能力。对化学试剂与生化试剂，如甲醛、羟胺、核酸酶类等表现出强抗性。对蛋白酶K、尿素、苯酚、氯仿等不具抗性。3.生物学特性朊病毒能造成慢病毒性感染而不表现出免疫原性，巨噬细胞能降低甚至灭活朊病毒的感染性，但使用免疫学技术又不能检测出有特异性抗体存在，不诱发干扰素的产生，也不受干扰素作用。总体上说，凡能使蛋白质消化、变性、修饰而失活的方法，均可能使朊病毒失活；凡能作用于核酸并使之失活的方法，均不能导致朊病毒失活。5.朊病毒的结构朊病毒蛋白有两种构象：细胞型（正常型PrPc）和搔痒型（致病型PrPsc）。两者的主要区别在于其空间构象上的差异。PrPc仅存在α螺旋，而PrPsc有多个β折叠存在，后者溶解度低，且抗蛋白酶解；PrPsc可胁迫PrPc转化为PrPsc

，实现自我复制，并产生病理效应；基因突变可导致细胞型PrPc中的α螺旋结构不稳定，至一定量时产生自发性转化，β片层增加，最终变为PrPsc型，并通过多米诺效应倍增致病。6.朊病毒引起的人和其它动物疾病疾病感染动物克－雅病（Creutzfeldt－JacobDisease,CJD）人库鲁病（Kuru）人裘－斯综合症（Gerstermann－Straussler－Scheinkersyndrome,GSS）人致死性家族失眠症（FatalFamilialInsommnia,FFI）人羊搔痒症（Scrapie）绵羊、山羊传播性貂脑病（TransmissibleMinkEncephalopathy）紫貂慢性消瘦病（ChroicWastingDisease,CWD）北美黑尾鹿、北欧大猎狗牛海绵状脑病（BovineSpongiformEncephalopathy,BSE）牛猫海绵状脑病（FelineSpongiformEncephalopathy,FSE）猫朊病毒发现的意义从理论上讲，“中心法则”认为DNA复制是“自我复制”，即DNA～DNA，而朊病毒蛋白是PrP→PrP，是为“自他复制”。这对遗传学理论有一定的补充作用。但也有矛盾，即”DNA→蛋白质”与“蛋白质→蛋白质”之间的矛盾。对这一问题的研究会丰富生物学有关领域的内容；对病理学、分子生物学、分子病毒学、分子遗传学等学科的发展至关重要，对探索生命起源与生命现象的本质有重要意义。从实践上讲，其对人畜健康；为揭示与痴呆有关的疾病（如老年性痴呆症、帕金森病）的生物学机制、诊断与防治提供了信息，并为今后的药物开发和新的治疗方法的研究奠定了基础GenomeofvirusesThesmallestgenomeMS2phage:3569bpHepatitisBvirus:3200bpThelargestgenome

Herpesviridae:120,000-220,000bpPoxviridae:130,000-375,000bpIridoviridae:170,000-400,000bp拟态病毒拟态病毒（mimivirus）的个体巨大，直径达到了500纳米——如果从这种病毒带有绒毛的外表算起，这种病毒的直径为750纳米。从这个意义上来说。这种病毒不只是比所有其他病毒都大上几倍，而且比许多细菌都大。1.拟态病毒（mimivirus）的形态2.拟态病毒（mimivirus）的发现Mimivirus的发现实际上始于1992年。当时，一位名叫蒂莫西.罗伯特姆的微生物学家发现，从冷却塔中提取的变形虫感染了一种神秘的寄生微生物。当时这位微生物学家以为这种生物是一种细菌，因此之时将其保存在一个冷冻设备中而并没有太在意，后来这种病毒被辗转运到了设在马赛的地中海大学的法国细菌学家贝尔纳.拉斯科拉德实验室。在电子显微镜下，拉斯科拉发现这种“细菌”与他所见过的任何细菌都完全不一样，它的外壳是一个由20个三角形表面组成的多面体。ASerendipitousDiscoveryLegionellosis:

LegionellaDiosease

AmebicdysenteryAcanthamoebapolyphagaAmebicliverabscessAmebickeratitisAmebicencephalitisAmebicencephalitisASerendipitousDiscovery—Agiantvirusinamoebae.Science

299(5615):2003.itwasnamed“Bradfordcoccus”ButnoproductwasamplifiedbyPCRusinguniversal16SrDNAbacterialprimersitisnotfilterablethrough0.4μmporesizefiltersitisGram’spositiveASerendipitousDiscoveryacharacteristicviralmorphologywithmatureparticlesof400nmindiameterandsurroundedbyanicosahedralcapsidNoenvelopewasobserved,but80-nmfibrilsattachedtothecapsidwerevisible.Atypicalvirusdevelopmentalcycle,includinganeclipsephase,wasobservedAsitresemblesabacteriumonGramstaining,itwasnamedMimivirus(forMimickingmicrobe)MimivirusparticleshaveasizecomparabletothatofsmallbacteriasuchasU.urealyticum.3.分类IthasnotbeenplacedintoaviralfamilybytheInternationalCommitteeonTaxonomyofVirusesbutmoremembersoftheproposedfamilyMimiviridaearethoughttoexistbasedonmetagenomicdata.Ithashowever,beenplacedintoGroupIoftheBaltimoreclassificationsystem.Whilstnotstrictlyamethodofclassification,MimivirusjoinsagroupoflargevirusesknownasnucleocytoplasmiclargeDNAviruses(NCLDV).Theyarealllargeviruseswhichsharebothmolecularcharacteristicsandlargegenomes.Themimivirusgenomealsopossesses21genesencodinghomologstoproteinswhichareseentobehighlyconservedinthemajorityofNCLDVs,andfurtherworksuggeststhatmimivirusisanearlydivergentofthegeneralNCLDVgroup.2、4.StructureofMimivirusCryoEMimagesofMimivirus(a)Anarrayofparticlesseparatedbytheviralfibers.(b)Anenlargedviewofoneparticleshowingatleasttwopossiblelipidlayers(straightarrows),theunanchorednuclearcapsid(whitearrowhead),theproteincapsid(betweenjaggedarrows),andthefiberswiththeir200A°thickbaselayer(blackarrowhead).(c)Enlargedviewofoneparticleshowingauniquevertexwhosewidthisabout600A°(blackarrows).RadialdistancesfromthecenterofthevirusareshowninA°.4.StructureofMimivirus3Dreconstructions

ofCryoEMimagesofMimivirus(a)Surface-shadedthree-dimensionalimagereconstructions,whereas(b)showsacentralcross-sectionslababout50A°thick.Thelefthalfof(a)and(b)areatacontourlevelthatincludesthedenserbaselayerofthefiberswhereastherighthalfof(a)and(b)areatahighercontourlevelthatshowsthecapsid.Theinternalunanchorednucleocapsidcanbeseenintheleftsideof(b)between800A°and1500A°radii.RadialdistancesfromthecenterareshowninA°in(b)andcanbecomparedtothoseinFigure1(b).4.Structureof

MimivirusAFMimagesofde-fiberedMimiviruses.AFMimageofde-fiberedvirusshowingonefaceofthevirion.(b)Astarfish-shapedfeatureonade-fiberedvirus.Thescalebarsrepresent1000Å4.StructureofMimivirusCryoEMreconstructionofMimivirusapplyingonlyfive-foldsymmetryaveraging.Surfaceshadedrendering(a,c)andcentralslices(b,d)ofcryoEMreconstructionofuntreatedMimivirus.(a,b)lookdownthestarfish-shapedfeatureassociatedvertexand(c,d)lookingfromoneside.Thecoloringisbasedo