单基因遗传病致病基因鉴定克隆的历史与发展

单基因遗传病致病基因鉴定克隆的历史与发展一、背景致病基因（PathogenicGenes）：如基因因其突变直接导致了某遗传病的发生，则该基因为某遗传病的致病基因，该基因突变则称为致病突变致病基因突变导致的单基因遗传病，亦称为孟德尔遗传病（MendelianHeritableDiseases）一、背景单基因遗传病包括：常染色体显性遗传病（autosomaldominant,AD），如亨廷顿病（HD）常染色体隐性遗传病（autosomalrecessive,AR），

如Wilson病（WD）X染色体显性遗传病（X-linkeddominant,XD），

如腓骨肌萎缩症（CMT）X染色体隐性遗传病（X-linkedrecessive,XR），

如假肥大性肌营养不良（DMD）Y染色体遗传病（Y-linked），如外耳道多毛症线粒体遗传病（mitochondrial,mt），

如线粒体脑肌病伴高乳酸血症和脑卒中样发作（MELAS）一、背景单基因遗传病少见或罕见，但由于其表型重、治疗效果差、致残致死率高，仍然给家庭、社会、国家带来沉重的负担，人们需要了解单基因疾病的发生发展过程，开发新的诊疗技术、治疗方法和干预策略另外一方面，单基因遗传病也提供了一个极好的研究疾病的发生发展过程的模式，如能促进对复杂性、常见疾病的发病机制研究一、背景单基因遗传病致病基因鉴定克隆有非常重要的意义，但是从2万5千多个人类基因中寻找致病基因显然并非易事，被形象的称为“干草堆内寻针”致病基因的鉴定克隆主要围绕着三个方面开展位于基因组的位置编码蛋白的功能与疾病表型关系

在对致病基因进行鉴定克隆的过程中，三个方面的信息是互

相补充、支持一、背景一、背景截止至2014年4月18日，OMIM网站共收录总条目近22,309条(收录表型条目7758条)：致病基因3,195个已明确致病基因的疾病表型条目5,202个OMIM收录的基因数Chr11,456Chr9562Chr17848Chr2928Chr10546Chr18215Chr3793Chr11895Chr19917Chr4567Chr12778Chr20376Chr5663Chr13274Chr21155Chr6874Chr14483Chr22356Chr7697Chr15439X809Chr8523Chr16597Y53二、致病基因的鉴定克隆功能克隆（functionalcloning）

基于疾病已知的生化基础寻找致病基因采用技术：蛋白质测序、寡核苷酸探针或特异性抗体分离cDNA等

成功案例：苯丙酮尿症、镰刀红细胞贫血病等

缺点：需要预先了解疾病相关蛋白的功能，大部分研

究中的遗传病不具有这样的先期条件二、致病基因的鉴定克隆苯丙酮尿症是小儿神经科常见的氨基酸代谢性疾病，因编码苯丙氨酸羟化酶的PAH基因突变导致其活性降低或丧失，促使过量苯丙氨酸和旁路代谢产物的堆积，产生神经毒性作用，造成患儿严重的智能障碍等

1953年，早在PAH基因被鉴定克隆30多年之前，就已经明确苯丙酮尿症是由苯丙氨酸羟化酶的功能异常所造成1982年，Robson等利用特异性抗体通过免疫共沉淀分离了小鼠肝脏组织中的PAH基因的mRNA病克隆了小鼠的cDNA1985年，Ledley等利用Robson克隆的小鼠PAH基因的cDNA作为探针，从人肝组织cDNA文库中成功分离了人PAH基因的cDNA并完成克隆1984年，Lidsky等利用Robson克隆的小鼠PAH基因的cDNA作为探针，运用人-鼠细胞杂交法将人PAH定位在12号染色体StanleyFetal.ProcNatlAcadSciUSA.1985Sep;82(18):6221-5.LedleyFDFetal.Science.1985Apr5;228(4695):77-9.二、致病基因的鉴定克隆定位克隆（positionalcloning）

仅根据致病基因在染色体的大体位置，鉴定克隆疾病的致病基因采用技术：连锁分析、体细胞杂交、染色体原位杂交等

成功案例：亨廷顿病、假肥大性肌营养不良等

缺点：需要大的家系作为基础，且人力物力耗费巨大二、致病基因的鉴定克隆亨廷顿病是人类历史上利用遗传多态标记定位遗传病的典型案例1983年， Gusells等通过艰辛的家系走访及分子生物实验，确定了亨廷顿病致病基因与D4S10连锁；值得一提的是，研究中的一个委内瑞拉家系很可能是至今为止科学研究中的最大家系，达3000多人此后，国际亨廷顿病协作组通过不懈的努力，逐渐将定位区间由最初的大于10cM遗传距离缩短到2.2cM遗传距离左右1993年，通过对该区间内基因的逐个鉴定测序，最终鉴定克隆亨廷顿病的致病基因—IT15（HTT），这已在定位亨廷顿病致病基因整整十年后TheHuntington'sDiseaseCollaborativeResearchGroup..Cell.1993Mar26;72(6):971-83.二、致病基因的鉴定克隆候选克隆（candidatecloning）

根据已知基因的相关信息，直接寻找可能与疾病生理

特征相关的基因采用技术：信息分析、体细胞杂交、寡核苷酸探针cDNA分离等

成功案例：神经性耳聋、发作性过度运动诱发性运动

障碍等

缺点：需要其他研究作为前期基础，具有相当大

的不确定性二、致病基因的鉴定克隆神经性耳聋的致病基因GJB3就是通过典型的候选克隆所鉴定在GJB3基因鉴定克隆之前，人们已确定GJB2的是某些常染色体隐性/显性遗传性耳聋的致病基因，其编码的蛋白属于connexin蛋白家族connexin蛋白在细胞粘附连接中起到重要作用，connexin蛋白家族有多少成员？其新的成员是否也会导致遗传性耳聋？1998年，夏家辉团队利用NCBI数据库中的表达序列标签（ESTs）数据进行分析，成功发现了connexin蛋白家族中的第31个蛋白，其编码基因是GJB3；并在两个神经性耳聋家系中发现了GJB3基因的致病突变，从而鉴定GJB3是神经性耳聋的致病基因XiaJHetal.NatGenet.1998Dec;20(4):370-3.二、致病基因的鉴定克隆定位候选克隆（positionalcandidatecloning）

是上述克隆策略的结合采用技术：连锁定位、Sanger测序、RT-PCR等

成功案例：CMT2L、遗传性帕金森病等

缺点：基于大的家系，在定位区间内寻找致病基

因的工作量仍然相当大二、致病基因的鉴定克隆定位候选克隆结合了定位克隆的优点，以家系为基础，定位致病基因在基因组的位置，从而消除了候选克隆的的不确定性定位候选克隆也吸收了候选克隆的优点，从定位区间一系列基因中通过生物信息分析筛选候选基因，逐一进行致病基因的鉴定二、致病基因的鉴定克隆CMT2L型的致病基因HSPB8就是通过典型的定位候选克隆所鉴定2004年，我们团队成功的将一个CMT2家系的致病基因定位于12q24一个长6.8cM的区域，并命名该型CMT为CMT2L2005年，我们团队在定位的基础上，将该定位区域内26个候选基因逐一进行了测序分析，发现HSPB8基因c.423G>T突变在该家系内共分离且正常人群中未发现，从而确定HSPB8是CMT2L的致病基因TangBSetal.HumGenet.2004May;114(6):527-33.TangBSetal.HumGenet.2005Feb;116(3):222-4.二、致病基因的鉴定克隆家族性PD致病基因SNCA的克隆是通过定位候选克隆策略完成1990年，Golbe等在意大利发现一个呈常显遗传的PD大家系

（4代60多例患者）1995年，Polymeropoulos等运用连锁定位技术，将致病基因定

位于4q21-q23长6.04cM区间其区间内SNCA基因编码的a-synuclein蛋白已有初步研究结果，

认为与阿尔茨海默病的淀粉样沉积有关基于连锁定位和已知的功能研究，Polymeropoulos认定SNCA

是最有可能的候选基因，遂在1997对前述意大利帕金森病

家系及三个希腊帕金森病家系进行了Sanger测序分析并家系

共分离，从而证实SNCA是该家族性帕金森病的致病基因Golbeetal.Annalsofneurology,1990,27(3):276-82.Polymeropoulosetal.Science,1996,274(5290):1197-9.Polymeropoulosetal.Science,1997,276(5321):2045-7.二、致病基因的鉴定克隆新一代测序克隆（nextgenerationsequencingcloning）

利用高通量测序鉴定克隆，结合或独立于以往的克隆策略采用技术：全基因外显子组测序、全基因组测序等

成功案例：SCA35、PKD等

缺点：单个样本价格昂贵、可能存在假阴性或假

阳性、对多种形式的突变无法检测二、致病基因的鉴定克隆新一代测序技术克隆是指利用全基因外显子组测序、全基因组测序、目标区域捕获等高通量测序技术，以家系或者同表型疾病群体为研究对象，寻找遗传病致病基因的策略新一代测序技术克隆可独立与以往的鉴定克隆策略，在家系中寻找共有突变（sharedmutation）或是在同表型疾病群体中寻找共有突变基因（sharedmutatedgene），直接得到候选基因也可以与以往的鉴定克隆策略相结合，利用连锁分析、生物信息分析等，进一步缩小候选基因范围，进一步确认致病基因二、致病基因的鉴定克隆SCA35的致病基因TGM6的克隆是通过新一代测序技术鉴定克隆我们团队，利用连锁分析，将一个呈常染色体显性遗传的SCA家系的致病基因定位在20p13-12.2长约18.45cM的区域通过对该家系中的四个患者进行全基因外显子组测序，发现在定位区间内只有一个位于TGM6杂合突变c.1550T>G在四个患者中共有，经Sanger测序分析证明该突变在家系内共分离在另外一个呈常染色体显性遗传的SCA家系也发现了TGM6突变，进一步从遗传学上证明TGM6是SCA35致病基因WangJLetal.Brain.2010Dec;133(Pt12):3510-8.二、致病基因的鉴定克隆我们团队在一个呈常染色体隐性遗传的SCA家系中发现其致病基

因CHIP，也运用新一代测序技术策略利用连锁分析，将该家系致病基因定位在16p13.3长约8.55cM的

区域通过对家系中两名患者进行全基因外显子组测序，发现两者在此

区域共有的纯合突变仅有位于CHIP基因的c.493C>T突变并在家系

内共分离在两个SCA家系中也发现了CHIP的突变且共分离，从而进一步证明了CHIP是常染色体隐性遗传的SCA的致病基因ShiYetal.PLoSOne.2013Dec2;8(12):e81884.二、致病基因的鉴定克隆2011年，Najmabadi等对136个近亲结婚成隐性遗传的智力障碍伊朗家系中的患者进行全基因外显子组测序并利用数据进行纯合子定位，发现了23个已知致病基因和50个新的待验证的智力障碍致病基因Najmabadietal.Nature.2011Sep21;478(7367):57-63.二、致病基因的鉴定克隆我们团队利用新一代测序技术进行碱基变异分析，同时开展纯合子定位我们将该近亲结婚呈隐性遗传的进行性肌阵挛癫痫（PME）家系中两位患者进行全基因外显子组测序，并利用测序数据中的变异检测得到的SNP点的基因型完成纯合子定位，最终发现两患者共有且位于纯合子定位区域的突变仅有位于SCARB2的c.1286G>A突变，证实该家系为极罕见的一种PME亚型HeMetal.ClinGenet.2014Mar13.doi:10.1111/cge.12338..二、致病基因的鉴定克隆一些发病年龄早、表型重的疾病，很难形成家系，如孤独症等，目前采用对正常父母+患病儿童高通量测序寻找新发突变的策略，已取得相当大成果O'RoakBJetal.NatGenet.2011Jun;43(6):585-9.二、致病基因的鉴定克隆另外,现代社会大家系越来越少，采用累积同表型小家系（2~3名患者）并对患者进行高通量测序后寻找共有基因的策略，也有一些研究团队特别是协作组开始采用，如癫痫Epi4K协作组就已采用累积癫痫小家系的策略寻找癫痫致病基因，拟于2015~2016年公布结果Epi4KConsortium.Epilepsia.2012Aug;53(8):1457-67.泛素及类泛素系统基因突变导致多种神经变性疾病PeptidesKawaguchietal.,1994;Kitadaetal.,1998;Leroyetal.,1998;Dingetal.,2006;Raoetal.,2010;Zhaoetal.,2011;Dengetal.2012;Margolinetal.,2013;Shietal.,2013.泛素活化酶(E1)泛素连接酶(E3)26SProteasome靶蛋白UbUbUbUb泛素/类泛素分子泛素结合酶(E2)靶蛋白靶蛋白类泛素分子细胞生理过程UbUb