(自动)核酸提取仪校准规范

JJF1874—20201(自动)核酸提取仪校准规范1范围本规范适用于全自动核酸提取仪和半自动核酸提取仪的校准。2引用文件本规范引用了下列文件:JJF1059.1—2012测量不确定度评定与表示JJF1101—2019环境试验设备温度、湿度校准规范JJF1527—2015聚合酶链反应分析仪校准规范凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规范。3概述(自动)核酸提取仪(以下简称提取仪)是应用核酸提取试剂完成样本核酸提取的一类核酸提取纯化设备,其原理是在一定温度、振动等条件下,对样本进行裂解、提取和纯化。提取仪由温控系统、振荡系统、取液系统和分离纯化系统全部或部分组成。4计量特性4.1温度示值误差4.2温度均匀性4.3温度稳定性4.4振动频率示值误差4.5振动频率稳定性4.6取液量示值误差4.7取液量重复性4.8取液量一致性4.9核酸提取回收率一致性4.10核酸提取回收率重复性4.11核酸提取回收率5校准条件5.1环境条件5.1.1环境温度:(10~30)℃。5.1.2相对湿度:≤80%。5.1.3提取仪所在室内不得有明显的机械振动,无电磁干扰。JJF1874—20202 5.1.4其他允许的环境条件。 5.2校准设备和标准物质5.2.1温度测量装置可至少同时测量7组温度数据,测量范围(0~120)℃,最大允许误差±0.3℃。5.2.2振动频率测量装置测量范围为(0.1~500)Hz,0.1级或优于0.1级。5.2.3电子天平分度值0.1mg,最大称量值≥200g,满足Ⓘ级要求,经过计量检定或校准。5.2.4核酸标准物质5.2.浓度≥1000ng/μL,相对扩展不确定度Urel≤5%(k=2)。经过校准,或用有证标准物质进行标定。6校准项目和校准方法6.1温度示值误差温度点一般选择55℃、65℃、90℃,或者其他有实际需要的温度为校准点。使用温度测量装置,将温度传感器固定在提取仪的加热模块上,温度传感器均匀分布,保证温度传感器与加热模块贴合紧密。对于不同加热模块的提取仪,可根据实际情况均匀选取测量点,测温点数选取规则如下:提取仪孔位数48位~96位,测温点选7个;提取仪孔位数8位~48位,测温点选5个;提取仪孔位数8位及以下的,测温点选3个。设定被校提取仪的校准温度,稳定10min或以上,待温度稳定后,读取测温点的温度值,根据公式(1)和公式(2)计算温度的示值误差。ΔTa=Ts-T(1)T=式中:Tii=1ΔTa———温控工作区域内温度示值误差,℃;Ts———温控工作区域内设定温度值,℃; T———所有测温点温度传感器测量值的平均值,℃;Ti———第i个温度传感器测量值,℃;n———测温点数量。6.2温度均匀性分别测试提取仪温度设定为55℃、65℃、90℃(也可选择其他有实际需要的温度进行测试)时工作区域的温度均匀性。根据公式(3)计算温度的均匀性。ΔTu=Tmax-Tmin(3)式中:ΔTu———温度均匀性,℃;JJF1874—20203Tmax—所有测温点温度传感器测量值的最大值,℃;Tmin—所有测温点温度传感器测量值的最小值,℃。注:若提取仪提取通道少于3个,则不做均匀性考察。6.3温度稳定性测试提取仪温度设定为65℃时加热区域的温度稳定性。待提取仪温度稳定后,测试10min,隔1min记录一次所有测温点温度传感器测量平均值,这些平均值极差的一半,冠以±号表示温度的稳定性。根据公式(4)计算温度的稳定性。ΔTw=±(Tmax-Tmin)(4)式中:ΔTw—温度稳定性,℃;Tmax—所有测温点温度传感器测量平均值中的最大值,℃;Tmin—所有测温点温度传感器测量平均值中的最小值,℃。6.4振动频率示值误差校准振动频率点选取提取仪频率设定最大值的20%(低)、50%(中)、80%(高)测量。待提取仪稳定5min后,设定待测频率值,分别测量低、中、高提取仪振动频率的示值,每个频率测量3次,根据公式(5)和公式(6)计算振动频率的示值误差。ΔFa=Fs-F(5)F=Fi(6) ΔFa ΔFa—振动频率示值误差,Hz;Fs—振动频率设定值,Hz; F—n次测量振动频率的平均值,Hz;Fi—第i次振动频率测量值,Hz;n—测量次数。注:若提取仪振动频率没有具体数值,则此项可以不做。6.5振动频率稳定性测试提取仪振动频率设定为中等值时振动频率的稳定性。选取振动频率为设定最大值的50%,待提取仪振动稳定后,测试10min,隔1min记一次振动频率,10min之内测得的振动频率极差的一半,冠以±号表示振动频率的稳定性。根据公式(7)计算振动频率的稳定性。ΔFw=±(Fmax-Fmin)(7)式中:ΔFw—振动频率稳定性,Hz;4 Fmax—振动频率测量值的最大值,Hz; Fmin—振动频率测量值的最小值,Hz。6.6取液量示值误差分别设定提取仪取液量为50μL、100μL、200μL,或者其他有实际需要的取液量作为校准点。超纯水作为被取液,选择一个通道,每个取液量测量3次,用电子天平称量所取液体质量,根据实验温度时水的密度,将所取液体的质量换算成体积,根据公式(8)和公式(9)计算取液量的示值误差。ΔVa=Vs-V(8)1nV1nΔVa—取液量示值误差,μL;Vs—取液量设定值,μL;Vii=1(9)V—n次取液量测量值的平均值,μL;Vi—第i次取液量测量值,μL;n—测量次数。6.7取液量重复性测试取液量设定值为100μL时提取仪取液量的重复性。选择一个通道重复取液7次,用电子天平称量所取液体质量,根据实验温度时水的密度,将所取液体的质量换算成体积,根据公式(10)计算不同取液量的重复性。RSD=(nV-iV)2××100%(10)式中:RSD—相对标准偏差,%;Vi—第i次取液量测量值,μL;V—n次取液量的平均值,μL;n—取液次数。6.8取液量一致性测试取液量设定值为100μL时提取仪取液量的一致性。用提取仪的多通道取液器取液一次,用电子天平分别称量各通道取液的质量,根据实验温度时水的密度,将所取液体的质量换算成体积,所有通道取液体积的极差表示取液量的一致性。根据公式(11)计算取液量的一致性。ΔVu=Vmax-Vmin(11)式中:ΔVu—取液量一致性,μL;Vmax—所有通道取液量的最大值,μL;5Vmin—所有通道取液量的最小值,μL。注:若提取仪取液通道少于3个,则此项可以不做。6.9核酸提取回收率一致性a)选择有证核酸标准物质,采用微量分光光度计测量其浓度,取3次测量的平均值作为核酸提取前的初始浓度。b)用提取仪对有证核酸标准物质进行核酸提取。根据实际情况,参考6.1中的选点方式,均匀选取测量点进行一致性考察。c)将每个孔中提取好的核酸样品溶液,分别用微量分光光度计测量其浓度。d)对比提取前后的核酸浓度,计算提取回收率。测试核酸标准溶液提取回收率的一致性,按6.1中的原则选取测试孔位,测量每个孔位提取后样品溶液中的核酸回收浓度。根据公式(12)、公式(13)和公式(14)计算所选孔位间核酸提取回收率的一致性。ΔCu=λ×(Cmax-Cmin)(12)λ=(13)ΔRu=×100%(14)式中:ΔCu—核酸回收浓度最大差值,ng/μL;Cmax—所有核酸回收浓度测量值的最大值,ng/μL;Cmin—所有核酸回收浓度测量值的最小值,ng/μL;λ—提取后的总体积和提取前加入标准物质的体积比值;Vc—提取后的总体积,μL;V0—提取前加入标准物质的体积,μL;C0—初始浓度,ng/μL;ΔRu—回收率一致性,%。注:若提取仪提取通道少于3个,则不做一致性考察。6.10核酸提取回收率重复性按6.1中的原则选取测试孔位进行核酸提取,把所有测试孔位提取后的样品溶液混合均匀,用微量分光光度计测量核酸浓度,计算核酸提取回收率作为一次测量结果,重复提取测量3次,根据公式(15)计算核酸提取回收率的重复性。RSD=××100%(15)式中:RSD—相对标准偏差,%;Rmax—n次回收率测量值中的最大值,%;Rmin—n次回收率测量值中的最小值,%; R—n次测量回收率的平均值,%;6R=λ× Cn—极差系数,n=3时,CnR=λ× 6.11核酸提取回收率 CC0×100%(16)把6.9得到的所有测试孔位提取后的样品溶液混合均匀,用微量分光光度计测量核酸浓度,重复测量3次,根据公式(16)和公式(17) CC0×100%(16)1nC1n式中:R—核酸提取回收率,%;Cii=1(17)C—n次测量浓度的平均值,ng/μL;C0—初始浓度,ng/μL。7校准结果表达经校准后的提取仪,出具校准证书,校准证书应符合JJF1071—2010中5.12的要求,校准原始记录格式参见附录A,校准证书(内页)格式参见附录B。8复校时间间隔由于复校时间间隔的长短是由提取仪的使用情况、使用者、提取仪本身质量等诸因素所决定的,因此,送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔。建议复校时间间隔不超过1年。JJF1874—20207附录A校准原始记录格式(参考)(自动)核酸提取仪校准记录共3页第1页仪器名称室温/℃仪器型号相对湿度/%制造厂校准员出厂编号核验员委托单位委托单号记录编号证书编号联系人及电话校准日期校准使用的仪器设备名称测量范围不确定度/准确度等级/最大允许误差检定/校准证书编号有效期至1.温度示值误差及均匀性温度℃Ti/℃T℃ aΔTa℃ΔTu℃12345675565902.温度稳定性温度℃ T/℃ ΔTw℃0min1min2min3min4min5min6min7min8min9min10min658共3页第2页3.振动频率示值误差振动频率Fs/HzFi/Hz F/Hz ΔFa/Hz123低中高4.振动频率稳定性振动频率F/HzΔFw/Hz0min1min2min3min4min5min6min7min8min9min10min中5.取液量示值误差取液量/μLVi/μL V/μL ΔVa/μL123501002006.取液量重复性取液量/μLVi/μL V/μLRSD/%12345671007.取液量一致性取液量/μLV/μLΔVu/μL123456781008.核酸提取回收率一致性Vc/μLV0/μLλ9共3页第3页C0/(ng/μL)Cu/(ng/μL)ΔCu/(ng/μL)ΔRu/%12345679.核酸提取回收率重复性C0/(ng/μL)Ci/(ng/μL)Ri/%Rmax-RminCnR/%RSD/%12312310.核酸提取回收率C0/(ng/μL)Ci/(ng/μL) C/(ng/μL)R/%12310附录B校准证书(内页)格式校准结果校准项目校准结果温度示值误差/℃标称值测量值示值误差扩展不确定度(k=2)温度均匀性/℃标称值均匀性温度稳定性/℃振动频率示值误差/Hz标称值测量值示值误差扩展不确定度(k=2)振动频率稳定性/Hz取液量示值误差/μL标称值测量值示值误差扩展不确定度(k=2)取液量一致性/μL标称值一致性11表(续)取液量重复性标称值/μL重复性/%核酸提取回收率一致性/%核酸提取回收率重复性/%核酸提取回收率/%核酸提取回收率扩展不确定度/%(k=2)校准员:核验员:12附录C温度示值误差校准结果的不确定度评定示例C.1测量模型ΔTa=Ts-T(C.1)式中: ΔTa—温控工作区域内温度示值误差,℃;Ts—温控工作区域内设定温度值,℃; T—所有测温点温度传感器测量值的平均值,℃。C.2不确定度来源温度示值误差校准结果的不确定度来源主要为:a)测量重复性引入的不确定度;b)温度测量装置引入的不确定度。C.3标准不确定度分量的评定C.3.1测量重复性引入的标准不确定度u(T)在各个温度测量时间段内,读取7个测温探头的数据,见表C.1,计算其实验标准偏差s。表C.1重复性引入不确定度数据温度/℃测量结果Ti/℃s/℃12345675550.3150.8950.7851.0451.8951.7650.710.576560.8459.9861.2560.9961.3361.0459.660.659084.0384.4184.8384.5284.6683.0484.670.61根据测量结果计算: (Ti-(Ti-T)2u(T)=结果见表C.2。(C.2)(C.3)C.3.2温度测量装置引入的标准不确定度u(Ts)温度测量装置校准不确定度按最大允许误差计算。u(Ts)=a/k=0.3℃/3=0.17℃13C.4标准不确定度分量汇总表表C.2标准不确定度分量汇总表温度/℃标准不确定度分量 u(T)/℃ u(Ts)/℃550.570.17650.650.17900.610.17C.5合成标准不确定度合成标准不确定为uc(ΔTa)=u2(T)+u2(Ts)结果列于表C.3。C.6扩展不确定度取包含因子k=2,则扩展不确uc(ΔTa)结果列于表C.3。表C.3合成标准不确定度和扩展不确定度温度/℃ uc(ΔTa)/℃ U/℃包含因子k550.591.22650.671.42900.631.3214附录D振动示值误差校准结果的不确定度评定示例D.1测量模型ΔFa=Fs-F(D.1)式中: ΔFa—振动频率示值误差,Hz;Fs—振动频率设定值,Hz; F—n次测量振动频率的平均值,Hz。D.2不确定度来源振动示值误差校准结果的不确定度来源主要为:a)测量重复性引入的不确定度;b)标准频率检测仪引入的不确定度。D.3标准不确定度分量的评定D.3.1重复性引入的标准不确定度u(F)在低、中、高三个频率振动点,分别读取10次检测数据,结果见表D.1,计算其实验标准偏差s。表D.1重复性引入不确定度数据频率振动点Fs/Hz测量结果Fi/Hzs/Hz12345678910低22.22.12.42.32.22.12.12.32.22.10.11中55.15.35.45.25.45.15.35.25.35.10.12高88.38.28.48.48.18.28.18.38.38.20.11根据测量结果计算: (Fi-(Fi-F)2u(F)=结果见表D.2。(D.2)(D.3)D.3.2振动频率测量装置引入的标准不确定度u2(Fs)振动频率测量装置校准不确定度按装置的最大允许误差计算。u(Fs)=a/k=FS×0.1%/3=0.29Hz15D.4标准不确定度分量汇总表表D.2标准不确定度分量汇总表频率振动点Fs/Hz标准不确定度分量 u(F)/Hz u(Fs)/Hz低20.0640.29中50.0690.29高80.0640.29D.5合成标准不确定度合成标准不确定度为uc(ΔFa)=u2(F)+u2(Fs)结果列于表D.3。D.6扩展不确定度取包含因子k=2,则扩展不确uc(ΔFa)结果列于表D.3。表D.3合成标准不确定度和扩展不确定度频率振动点Fs/Hz uc(ΔFa)/Hz U/Hz包含因子k低20.300.602中50.300.602高80.300.60216附录E取液量示值误差校准结果的不确定度评定示例E.1测量模型ΔVa=Vs-V(E.1)式中: ΔVa—取液量示值误差,μL;Vs—取液量设定值,μL; V—n次取液量测量值的平均值,μL;E.2不确定度来源取液量示值误差校准结果的不确定度来源主要为:a)测量重复性引入的不确定度;b)电子天平引入的不确定度。E.3标准不确定度分量的评定E.3.1重复性引入的标准不确定度u(V)设定取液量为50μL、100μL、200μL,每个取液量设定点分别测量10次取液量,结果见表E.1,计算其实验标准偏差s。表E.1重复性引入不确定度数据Vs/μLVi/μLs/μL123456789105047.2450.1148.6949.1048.1848.2147.8848.5147.7147.840.8110099.4599.38100.299.1697.8499.4598.3599.8698.3597.500.89200200.1198.6200.9198.2199.0200.3199.8198.6199.5200.50.92根据测量结果计算: (Vi-V(Vi-V)2u(V)=结果见表E.2。(E.2)(E.3)E.3.2电子天平引入的标准不确定度u(Vs)电子天平引入的不确定度按电子天平的最大允许误差计算。u(Vs)=a/k=0.5mg/(0.996511mg/μL×3)=0.29μL17E.4标准不确定度分量汇总表表E.2标准不确定度分量汇总表Vs/μL标准不确定度分量 u(V)/μL u(Vs)/μL500.470.291000.510.292000.530.29E.5合成标准不确定度合成标准不确定度为uc(ΔVa)=u2(V)+u2(Vs)结果列于表E.3。E.6扩展不确定度取包含因子k=2,则扩展不确uc(ΔVa)结果列于表E.3。表E.3合成标准不确定度和扩展不确定度Vs/μL uc(ΔVa)/μL U/μL包含因子k500.551.121000.591.222000.601.22JJF1874—202018 附录F 核酸提取回收率校准结果不确定度评定示例F.1测量模型R=λ××100%(F.1)C=Ci(F.2)式中:R—核酸提取回收率;C—n次测