重金属胁迫对几种淡水微藻生长和叶绿素荧光参数的影响

摘要：使用不同Cd2+、Pb2+处理新安江流域分离的两种优势绿藻急尖栅藻（Scenedesmusacutus）和弓形藻（Schroederiasp.），每种重金属设单独4个梯度，Cd2+为0、0.5、1、2mg/L，Pb2+为0、5、10、15mg/L，以及复合重金属4个梯度（Cd2++Pb2+），在6000lux光照培养箱中培养96h。每隔24h测定叶绿素荧光参数，细胞浓度，并于96h后测定叶绿素。实验结果表明：Cd2+、Pb2+对两种藻类的细胞浓度具有显著性影响（p<0.05），高浓度组对细胞生长具有明显的抑制作用；叶绿素a在各个梯度内随着浓度的升高而下降；各组重金属处理藻体96h表明，毒性大小顺序：Cd2+>Cd2++Pb2+>Pb2+；急尖栅藻和弓形藻的对重金属的耐受性也有所不同，弓形藻对Cd2+和Pb2+的耐受能力均强于急尖栅藻；处理96h后所测得的叶绿素荧光参数表明，最大相对电子传递速率(rETRmax)除弓形藻Cd2+浓度处理外，其余处理均有显著性差异（p<0.05），且对急尖栅藻的抑制率较弓形藻较高；光能的利用率(α)在所有梯度下均无显著性差异（p>0.05）；饱和光强(Ik)对急尖栅藻Cd2+、Pb2+各浓度之间有显著性差异（p<0.05），其余梯度均无无显著性差异(p>0.05)。实验结果表明，受重金属处理时间越长，胁迫作用越显著。关键词：急尖栅藻；弓形藻；Cd2+；Pb2+；生理生态；叶绿素荧光EffectsofHeavyMetalStressontheGrowthandChlorophyllFluorescenceParametersofSeveralFreshwaterMicroalgaeAbstract:DifferentCd2+andPb2+treatmentswereusedtotreattwodominantChlorophytaspecies,ScenedesmusacutusandSchroederiasp.,fromXin'anRiver.Fourgradientswereusedforeachheavymetalindividuallyorcombinethetwotogether,theCd2+concentrationwere0,0.5,1,2mg/L,andthePb2+concentrationwere0,5,10,15mg/L,culturedinlightintensityof6000luxfor96h.Chlorophyllfluorescenceparameters,cellconcentrationweremeasuredevery24h,andchlorophyllweremeasuredafter96h.TheresultsshowedthatCd2+andPb2+hadsignificantdifferenceincellgrowthoftwoalgae(p<0.05),andhighconcentrationgrouphadsignificantinhibitoryeffectonalgaeconcentration;chlorophylladecreasedwithincreasedheavymentalconcentrationineachgradientafter96htreatments,theorderoftoxicitywas:Cd2+>Cd2++Pb2+>Pb2+;andScenedesmusacutusandSchroederiashoweddifferentresistancetothesetoxicityheavymentals.ThetoleranceabilityofSchroederiatoCd2+andPb2+wasbetterthanthatofScenedesmusacutus.ThemaximumrelativeelectrontransportraterETRmaxweresignificantlydifferentexceptfortheCd2+concentrationofSchroederia(p<0.05),andtheinhibitionrateagainstScenedesmusacutuswasstrongerthanthatofSchroederia.Thelightusingefficiencyoflightwasnosignificantdifferenceinallgradients(p>0.05);andIkhadsignificantdifferencebetweenCd2+andPb2+concentrations(P<0.05),andtherewasnosignificantdifferenceinothergradients(p>0.05).Ourresultsshowedthatthelongerthetreatmenttimeofheavymetals,themoresignificantthestress.Keywords:Scenedesmusacutus;Schroederiasp.;Cd2+;Pb2+;physiologicalecology;chlorophyllfluorescence1引言重金属是比重在4~5以上的金属，如汞、锌、铅、铬、镉、锰、钒、钼等[1]在自然界水体中的重金属含量很少，来源于土壤、岩石中，一般不会对生命机体造成伤害[2]，但随着科技进步和人类的不断发展，工业、农业频频崛起，特别是采矿、冶炼、化工、电镀、电子、制革等行业的高速发展，大量化肥、农药的施用，使得各种重金属污染物进入水体，人类活动也日益频繁，各种生活垃圾、固体废弃物不合理的填埋和处理，也会导致水体重金属污染现象，这些以各种形态和形式进入环境的重金属日趋增加，它们不易被生物降解，稳定性强，可通过食物链直接或间接影响到人类身体健康，并对水体生态系统造成严重危害[3]，因此，水体重金属污染已成为当今世界上最严重的环境问题之一。浮游藻类是水环境中的主要初级生产者，也是水产养殖中重要的生物饵料[4]，重金属通过各种途径进入水体后，首当其冲受害的就是藻类生物。藻类因其个体小，繁殖快、对污染物敏感、易于分离培养并可直接观察细胞水平上的中毒症状，是一种较理想的生物监测材料。一般情况下，重金属对藻类的毒性效应表现在：影响藻类的生长代谢、抑制光合作用、减少细胞色素、导致细胞畸变、改变天然环境中的藻种组成等[5]有关藻类在重金属胁迫下的细胞形态、生长量、生理生化和耐受性的研究较多[3,6-10]，但新安江流域的浮游藻类对重金属响应的研究尚未见报道。新安江流域是我国为数不多的未富营养化、总体水质较好的水体之一。在当前我国生态文明建设以及新安江流域生态补偿机制的建立这一背景下，保护新安江及其支流的水环境与生态安全意义重大。新安江流域内浮游植物种类丰富，其中以绿藻和硅藻为主[11-13]，多数浮游植物可作为水质变化的指示种，可表征水质状况及污染程度[11]。管后春等[14]研究结果表明，黄山市表层土壤轻污染以上的面积占总面积的2.65％，主要为镉和汞，但二级（潜在污染）的土壤面积占总面积的75.44％，主要为砷、镉、铜、铬、汞、铅、锌[14]。这一研究结果表明，黄山市土壤总体质量良好，但大部分面积已受到重金属潜在污染。由于土壤受污染的区域大都分布在新安江流域的两侧，因此，我们不得不预防由于土壤污染可能引起的水体重金属污染。而重金属污染如何影响典型浮游植物类群的生长、数量、光合作用和光合活性，重金属污染对新安江流域典型浮游植物的生理生长指标影响如何又是怎样不得而知，因此拟选取新安江流域内分离的典型浮游植物为研究材料，结合毒理、生理生化等多种研究方法，探讨重金属胁迫对藻类的耐受性影响，初步判断新安江流域典型藻类对重金属的耐受性和敏感性，旨在为水体重金属污染的生物修复提供更优异的藻种，同时为该流域上、下游及部分支流可能发生的重金属污染的预警、预防及水生态保护提供基础理论数据。2实验材料与方法2.1实验材料实验藻种为弓形藻（Schroederiasp.）和急尖栅藻（Scenedesmusacutus），藻种来自新安江流域黄山学院自分离微藻库中培养的单种藻（无原生动物的单一藻种）。以BG11培养基为基础培养基，实验中镉离子选用PbCl2(分析纯)、CdCl2（分析纯），使Cd2+终浓度分别为0、0.5、1和2mg/L，使Pb2+终浓度为0、5、10、15mg/L，混合浓度组设4组，分别是空白组0、组别1(Cd2+0.25+Pb2+2.5mg/L)、组别2(Cd2+0.5+Pb2+5mg/L)、组别3(Cd2+1+Pb2+7.5mg/L)，每个浓度设三个平行重复。2.2实验方法实验开始前先将藻种活化预培养7天，当藻种处于指数生长期时，取藻计算细胞浓度，决定接种体积，以便调整初始接种密度为1×105Cells/mL，每瓶培养体积为500mL，实验在GZL-P系列型智能光照培养箱(合肥华德利科学器材有限公司)中培养，用光强计(深圳华盛昌机械实业有限公司)测定光照培养箱六面光强之和为6000Lux，光暗比为12L:12D，培养温度设定为25(±1)℃。培养时每天于固定时间充分摇动藻液3次，接种时为第0h，接种后每隔24h测定一次叶绿素荧光参数和细胞浓度,期间取藻时需严格保证无菌操作。96h后抽滤藻液用于测叶绿素。2.3参数测定2.3.1细胞浓度的测定实验开始后，每隔24h将藻液摇匀后，取680uL于离心管中，加入20uL甲醛，用血球计数板计数，每个样品离心管观察3个装片，取得平均数。比生长率μ的计算公式：(2-1)式中：Nt是第t天的细胞数量(个)；N0为初始细胞数量(个)；t为培养的时间(d)。2.3.2叶绿素荧光参数的测定实验开始后，每隔24h将藻液摇匀后，取15mL采用德国Walz公司生产的浮游植物荧光仪（phyto-PAM）测定各项叶绿素荧光参数。测定前，将重金属处理的实验藻种样品进行10min暗适应，然后用phyto-PAM测定最大相对电子传递速率（rETRmax），饱和光强（Ik）和光能的利用率（α）等参数。叶绿素荧光参数测定公式[15]:快速光响应曲线拟合方程:Y=rETRmax*(1-exp(-a*x/rETRmax))(2-2)Ik的计算方法如下:Ik式中，rETRmax为最大相对电子传递速率，α为快速光曲线的初始斜率，Ik是初始斜率线和rETRmax水平线的交点在坐标横轴上的投影点。2.3.3叶绿素含量的测定另取150mL藻液于0.22um滤膜（WhatmanGF/F）上进行真空抽滤。将附着藻液的滤膜放置于15mL离心管，加入5mL甲醇后避光放进冰箱（4℃）内过24h后测量。然后将提取液在离心机内离心10min(3000r/min)，最后使用双光束紫外可见分光光度计（TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司，中国）测定上清液全波段(480—750nm)的吸光值，根据公式计算出叶绿素a、叶绿素c和类胡萝卜素的含量。叶绿素含量的计算公式[16]：叶绿素a=16.29×A665-A750-类胡萝卜素=7.6×A480-A750叶绿素c=28.819×A632-A式中：A480、A510、A635、A652、A665、A668、A750是指离心上清液在480nm、510nm、635nm、652nm、665nm、668nm、750nm波长下的吸光值。2.3.4统计分析使用GraphPadPrism7.0软件进行作图及显著性分析使用one-wayANOVA(andnonparametric)，置信水平设置为95%。3结果与分析3.1细胞浓度变化及分析在两种重金属的胁迫作用下两种藻经过96h的生长趋势与藻终浓度如图3-1、图3-2所示。方差分析显示，两种重金属对急尖栅藻与弓形藻的生长均有极显著差异(p<0.0001)。其中Pb2+在低浓度时对急尖栅藻的生长起促进作用，在高浓度时起抑制作用。Cd2+对急尖栅藻的抑制作用较Pb2+要强。急尖栅藻各梯度之间均无显著性差异(p>0.05)，弓形藻各梯度之间也无显著性差异(p>0.05)。对比两种藻，弓形藻与急尖栅藻的细胞浓度有显著差异(p<0.01)。弓形藻较急尖栅藻耐受性更强，在各个重金属梯度内，弓形藻的细胞浓度都要更高一些。对比两种重金属下两种藻的比生长率，比生长率最大的是弓形藻Cd2+0.5mg/L时，达到了0.66。急尖栅藻在Pb2+5mg/L时比生长率最大达到0.53。急尖栅藻和弓形藻都在Cd2+2mg/L时比生长率达到最低值，分别为0.06、0.27。图3-1两种藻在不同重金属浓度下的细胞浓度（A：Cd2+下的急尖栅藻；B：Cd2+下的弓形藻；C：Pb2+下的急尖栅藻；D：Pb2+下的弓形藻；E：复合重金属下的急尖栅藻；F：复合重金属下的弓形藻）图3-296h后细胞浓度3.2叶绿素变化分析96h后两种重金属作用下的叶绿素a含量如图3-3所示，叶绿素a和类胡萝卜素含量如表3-1、表3-2所示。对叶绿素进行方差分析可知，急尖栅藻的叶绿素a、类胡萝卜素、叶绿素c有极显著性差异(p<0.01)，其中叶绿素c与类胡萝卜素、叶绿素a均有显著性差异(p<0.05)。急尖栅藻的叶绿素a、类胡萝卜素、叶绿素c有极显著性差异(p<0.0001)，其中叶绿素a、类胡萝卜素与叶绿素c两两均有极显著性差异(p<0.0001)。从叶绿素a分析，Cd2+对急尖栅藻为抑制作用，且随浓度的增加抑制程度增加。Cd2+对弓形藻的抑制作用很强，但是均在0.34~0.42μg/mL之间，梯度之间的差距不大。从叶绿素a分析，Pb2+对急尖栅藻为抑制作用，且随浓度的增加抑制程度增加。Cd2+对弓形藻在低浓度5mg/L时为促进作用，在高浓度时为抑制作用。复合重金属组在低浓度第1梯度对急尖栅藻和弓形藻均为促进作用，在高浓度时均为抑制作用，且对急尖栅藻的抑制作用较弓形藻要强。图3-3两种藻在不同重金属浓度下的叶绿素a表3-1急尖栅藻类胡萝卜素和叶绿素c含量(x+SD)急尖栅藻叶绿素a(ng/cell)类胡萝卜素(ng/cell)叶绿素c(ng/cell)00.70±0.370.49±0.200.09±0.04Cd2+0.5mg/L0.66±0.130.87±0.080.08±0.02Cd2+1mg/L0.40±0.082.15±0.140.05±0.01Cd2+2mg/L0.13±0.031.99±0.390.02±0.00Pb2+5mg/L0.86±0.310.67±0.310.09±0.03Pb2+10mg/L0.69±0.260.51±0.030.08±0.03Pb2+15mg/L0.63±0.180.34±0.090.07±0.02复10.35±0.080.79±0.080.05±0.01复20.30±0.030.90±0.200.04±0.01复30.20±0.100.47±0.290.03±0.02表3-2弓形藻类胡萝卜素和叶绿素c含量(x+SD)弓形藻叶绿素a(ng/cell)类胡萝卜素(ng/cell)叶绿素c(ng/cell)00.65±0.060.31±0.040.08±0.01Cd2+0.5mg/L0.42±0.090.20±0.040.04±0.01Cd2+1mg/L0.42±0.130.24±0.070.06±0.02Cd2+2mg/L0.35±0.050.17±0.020.04±0.01Pb2+5mg/L0.75±0.190.36±0.080.10±0.02Pb2+10mg/L0.59±0.210.29±0.100.06±0.03Pb2+15mg/L0.57±0.060.27±0.030.07±0.01复10.90±0.240.42±0.110.11±0.02复20.59±0.080.29±0.030.06±0.02复30.51±0.040.24±0.020.06±0.013.3叶绿素荧光参数分析根据96h测量的诱导曲线和快速光响应曲线，得到潜在最大相对电子传递速率rETRmax，快速光曲线的初始斜率斜率α与耐受强光能力Ik等3个叶绿素荧光参数。3.3.1光能的利用率（α）分析α为快速光曲线的初始斜率，反映的是光合器官对光能的利用效率。如图3-4所示为各浓度组α与空白组α的变化率。对α进行方差分析，发现α各组数据之间均无显著性差异(p>0.05)。Cd2+对急尖栅藻的影响差距较大，既有促进也有抑制，但抑制比例比促进的比例大，总体可以说是抑制占主导的。在48h2mg/L时达到促进最大值23.6%，在72h0.5mg/L时达到了抑制最大值50.0%。高浓度组2mg/L的抑制率较低浓度组0.5mg/L组的抑制率要小。Cd2+对弓形藻在48h以促进为主，96h以抑制为主。高浓度组2mg/L的抑制率较低浓度组0.5mg/L组的抑制率要大，在48h2mg/L时达到抑制率最大值18.2%。Pb2+对急尖栅藻以抑制为主，除了48h时有促进作用，其余皆为抑制。在此组中10mg/L的抑制率要比5、15mg/L的抑制率都要高。Pb2+对弓形藻的影响参差不齐，前72h以促进为主，96h则为全抑制。复合重金属对急尖栅藻表现为全抑制，且复合重金属梯度中第2梯度的抑制率相较于其它两组要高。复合重金属对弓形藻48h内表现为抑制，96h表现为促进，在72h第3梯度时达到最大促进率19.5%。从这组复合金属可看出弓形藻对复合重金属的耐受性较急尖栅藻要好。图3-4两种藻在不同重金属浓度下的α的变化率（A：Cd2+下的急尖栅藻；B：Cd2+下的弓形藻；C：Pb2+下的急尖栅藻；D：Pb2+下的弓形藻；E：复合重金属下的急尖栅藻；F：复合重金属下的弓形藻）3.3.2最大相对电子传递速率rETRmax最大相对电子传递速率rETRmax是由快速光响应曲线拟合出来的，如图3-5所示为各浓度组rETRmax与空白组rETRmax的变化率。对rETRmax进行方差分析，急尖栅藻Cd2+、Pb2+、复合金属各浓度之间均有显著性差异(p<0.05)。弓形藻除了Cd2+浓度(p>0.05)外，其余重金属之间均有显著性差异(p<0.05)。Cd2+对急尖栅藻的抑制性很强，抑制率最大的在72h的2mg/L时，较空白组抑制了76.6%，在此组别除了48h的0.5mg/L时有促进作用，其余各组均为抑制。Cd2+对弓形藻的抑制相较于急尖栅藻稍轻微，但也是各组中抑制率及抑制程度最高的，全组抑制程度达到了100%，抑制率最高在第四天1mg/L时达到了58.6%。Pb2+对急尖栅藻的抑制率较低，甚至部分有促进作用，在48h的10mg/L时达到了最高促进率21.4%。Pb2+对弓形藻的抑制率是较急尖栅藻会低一些，在前72h以促进作用为主，96h时则为抑制作用。复合重金属对急尖栅藻基本也是抑制作用，除了48h时有促进作用，其余时间的各梯度都是抑制作用。复合重金属对弓形藻的促进率最大，全组除了48h的2、3梯度，其余全为促进作用。对弓形藻促进率的最大值在72h的第2组，达到了44.1%。图3-5两种藻在不同重金属浓度下的rETRmax的变化率（A：Cd2+下的急尖栅藻；B：Cd2+下的弓形藻；C：Pb2+下的急尖栅藻；D：Pb2+下的弓形藻；E：复合重金属下的急尖栅藻；F：复合重金属下的弓形藻）3.3.3饱和光强（Ik）分析如图3-6所示为各浓度组Ik与空白组Ik的变化率。对Ik进行方差分析，急尖栅藻Cd2+、Pb2+各浓度之间均有显著性差异(p<0.05),)，复合重金属各浓度无显著性差异(p>0.05)。弓形藻Cd2+、Pb2+、复合金属各浓度之间均无显著性差异(p>0.05)。Cd2+对急尖栅藻的抑制率随天数变长而变大，最后趋于稳定。Cd2+对急尖栅藻的抑制率很大，在48h的2mg/L时抑制率达到了最大，为80.6%。Cd2+对弓形藻的抑制率也很大，在96h的1mg/L时抑制率达到了最大为64.5%。除了48h的0.5mg/L时有促进作用，其余全为抑制。Pb2+对急尖栅藻在前72h为促进作用，在96h为抑制作用。促进作用在第2天10mg/L达到了最大值17.2%。Pb2+对弓形藻在前72h基本为促进作用，在第96h为抑制作用。复合重金属对急尖栅藻分浓度影响，低浓度第1梯度为促进作用，高浓度第3梯度主要为抑制作用。复合重金属对弓形藻基本为促进作用，部分虽为抑制作用，可是抑制作用很弱。复合重金属对弓形藻促进作用很强，在72h第2梯度达到最大值为28.8%。图3-6两种藻在不同重金属浓度下的Ik的变化率（A：Cd2+下的急尖栅藻；B：Cd2+下的弓形藻；C：Pb2+下的急尖栅藻；D：Pb2+下的弓形藻；E：复合重金属下的急尖栅藻；F：复合重金属下的弓形藻）4分析与讨论在当前我国生态文明