双脱氧末端终止法测序

PAGEPAGE5快速序列测定：双脱氧末端终止法06级生科A班苏狄064120202摘要：核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中一项重要技术。目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977年）提出的双脱氧链终止法及Maxam和Gilbert（1977年）提出的化学降解法，其中双脱氧链终止法是目前应用最多，最好的技术。关键词：快速序列测定、双脱氧末端终止法目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300~500个核苷酸的单链DNA分子。DNA序列测定的简便方法为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。此外，新的测序方法亦在不断出现，如上世纪90年代提出的杂交测序法（sequencingbyhybridization，SBH）等。双脱氧末端终止法测序一、原理双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP）（图7-4-1），可以通过其5′三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯键。因此，正在增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。这样，在4组独立的酶反应体系中，在4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。双脱氧链终止法测序原理如图7-4-2所示。图7-4-1脱氧核苷三磷酸和双脱氧核苷三磷酸分子结构55′GAGTCACACTTGAC——3′待测单链DNA33′CTG—5′引物、Klenow酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和少量α-32P-dATP浓度的dNTP的较低温度，以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记dNTP和较低温度，以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记dNTP的有效掺入，这步反应的产物是仅仅延伸了20-30碱基的引物。再将第一步反应等分于4组1套的标准反应系统中，每组反应中都含有高浓度的dNTP和一种ddNTP。这样聚合反应就得以继续，直至造成链终止的核革酸掺入正在增长的链中。（4）TaqDNA聚合酶：适用于测定在37℃形成大段稳定十级结构的单链DNA模板序列。这是因为TaqDNA聚合酶在70-75℃活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构。按照1nnis等（1988）介绍的方法使用TaqDNA聚合酶进行测序，在放射自显影片上得到的测序梯连续数百个碱基条带始终清晰如一，表明这种酶的持续合成能力甚佳。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。循环测序法利用了热循环仪的自动循环的高效能力。循环测序反应与普通PCR反应有所不同。只需一条引物，通过单引物进行热循环，模板DNA以线性方式被扩增，而不是标准PCR的指数方式扩增；反应底物除四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，还加入了双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），进行扩增时，链的延伸终止于掺入ddNTP的位置，产生分别终止于不同核苷酸的一系列不同长度的扩增片段。（四）放射性标记的dNTP传统的DNA测序方法都采用α-32P-dNTP作为放射性标记物，但由于32P发射的高能β射线，常会引起二个问题。首先是导致放射自显影图谱条带扩散、分辨率低，限制了识读序列的数量和准确性。其次是32P衰变会导致DNA样品分解，通常都应在测序反应后24h内进行电泳，否则无法获得好的结果。近年来α-35S-dNTP被广泛采用，是由于35S产生较弱的β射线，克服了32P的二大缺点。放射自显影图谱具有较高的分辨率和较低的本底，测序反应产物可在-20℃保存一周，而分辨率并不下降。（五）dNTP类似物二重对称的DNA区段（特别是GC含量高者）可以形成链内二级过程中不能充分变性。因此将引起不规则迁移，使邻近的DNA条带压缩在一起，以致难以读出序列。这种压缩现象归因于DNA二级结构的存在，而且不可能通过改变测序反应中出序列。这种压缩现象归因于DNA二级结构地存在，而且不可能通过改变测序反应中所用DNA聚合酶的种类而得到减轻。但是凝胶中的压缩区段往往可以通过采用诸如dITP（2'－脱氧次黄苷15'－三磷酸）或7－脱氮－dGTP（7－脱氮－2'－脱氧鸟苷－5'－三磷酸）等核苷酸类似物进行分辨。这些类似物与普通碱基的配对能力较弱，而且是测序酶和TaqDNA聚合酶等DNA聚合酶的合适底物（Gough和Murray，1983;Mixusawa等，1986;Innis等，1988）。但对某些压缩条带，7－脱氮－dGTP无济于事；同样，dITP也无补于另一压缩条带（尤其是得于GC丰富区的缩条带）的分辨。如果需要采用类似物，首先可试用dOTP，如果压缩条带用dITP或7－脱氮－dGTP都无法分辨，则转而测定另一条链的DNA序列几乎总能如愿以偿。如上所述，两种形式的测序酶和TaqDNA聚合酶对核苷酸类似物的耐受性优于大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段。此外，制造厂商声称在测定含稳固二结构的模板序列时，测序酶2.0版要优于原来的测序酶。测序酶2.0版持续合成能力强于测序酶，其作用总是一气呵成，很少半途而废，因而消除了“鬼”带。而且，测序酶2.0版对诸如dITP类核苷酸类惟物的耐受性看来也优于原来的测序酶。（六）关于DNA序列的识读DNA序列的识读是一个熟能生巧的过程。注意几点技巧：①在显影前后一定要注意标明模板名称、日期和测序人等，并标明各套反应位置；②识读时从显而易见的特征序列开始，如连续的同聚核苷酸（如TTTTT、AAAAA）或交替出现的嘌呤和嘧啶（如GTGTGTGT），一旦找到这种序列，便可较快地确定目的序列的位置。三、双脱氧链止终法测定战略由于DNA一般都由几千个单核苷组成。而目前测定DNA序列的最好方法，一次也只能测约600个核苷酸，因此进行DNA顺序测定前，需要用不同限制酶pUC1,18pUCl18,pUC19,M13mp18,M13mp19等载体中，分别测定各小片段的顺序，由于不同限制酶产生的片段之间有交错重叠顺序，根据片段间和末端重叠序列，用计算机软件如MacVectorTM5.0分析DNA，AssemblylignTM排列出各片段的位置，进而排出DNA的全序列。四、双脱氧链终止法测定方法以M13噬菌体为载体的双氧链终止法的实施步骤为例：1．M13噬菌体复制型双链DNA（RFDNA）的制备。为了将待测双链DNA进行克隆，必须制备M13mp18或M13mp19复制型（闭环双链）DNA，从M9培养基中，挑起单个克隆大肠杆菌，JM101到50ml2×YT培养基中，37℃振荡过夜。稀释1ml培养物到50ml2×YT培养中，于37℃振摇6h，转移2ml培养物于微量离心管中，12000g，离心5min细菌沉淀保留用于分离复制型RFDNA，上清用于分离噬菌体单链DNA。细菌沉淀用于分离复制型DNA，可以采用标准的碱解方法或采用天美公司的WizardMiniperpsDNA试剂盒制备。（方法同分离质粒DNA方法）。2．重组噬菌体制备采用多克隆位点上的限制性内加酶切割待测DNA，并采用相同内切酶切割M13噬菌体RFDNA（采用Biol101genecleanⅡ试剂盒分别纯化内切酶切割后的DNA片段），然后将待测外源DNA片段与M13复制型载体DNA连接过夜，连接反应物转染JM101感受态细菌，将连接物10μl与200μl感受态细菌混匀，放置冰上40～50min，再放在42℃水浴2min，然后加入1ml新鲜的静止相JM101培养物混匀，然后分别以300μl于含有IPIG（200mg/ml）和X-gal200mg/ml的2×YT培养基上，于37℃培养8h即可出现蓝色和白色噬斑，白色或称无菌噬斑，即为阳性重组噬菌体。3．单链噬菌体DNA（模板DNA）的制备上述平板的每个白色噬菌斑是由一种重组M13DNA分子转染细菌后产生的，如果取一个白色噬菌斑进行培养便可得到一种单链形式的DNA。为此，挑取一个白色噬菌斑转接到一个新鲜制备的OD600=0.1的大肠杆菌JM101培养物中，于37℃振摇5h左右，12000g离心10min，上清转移到另一新微量离心管中用于分离单链DNA，按1ml上清液中加入含20%聚乙二醇PEG-6000的2.5mNaCl200μl沉淀噬菌体，再用饱和酚抽提除去噬菌体蛋白，最后用1/10体积的3mNaAc和乙醇沉淀单链DNA，浓度调至0.1～0.5μg/μl，也可采用天美公司的WizardTMM13DNA纯化试剂盒分离纯化M13单链DNA。4．引物制备可以购买通用引物或实验室合成15bp～26bp长度的引物，通常以2μg/ml的浓度贮存于-20℃备用。5．微量滴板进行大批量的模板测序时，常在密闭的微量离心管中进行与引物的退火反应，然后在微量滴板中进行链延伸-链终止反应。6．变性聚丙烯酰胺凝胶测序凝胶装置的大小形状均不相同，其主要参数有：①长度通常为40～50cm；②宽度通常为20cm；③厚度通常为0.3～0.4mm；④横截面形状为楔形或锥形，即顶部薄，底部厚，或者是将底部凝胶缓冲液的浓度提高；⑤加样槽；⑥整块凝胶上的温度