第6章-骨组织工程

生长因子的定义

生长因子(growthfactor，GF)是通过细胞间信号传递影响细胞活动的一类多肽因子。它对细胞具有促进或抑制其分裂增殖、迁移和基因表达的作用。将生长因子加入到细胞培养体系中，保证生长因子在体外环境下能够有效发挥作用非常重要。这需要解决两个难题，其一，促进生长因子维持活性；其二，保证生长因子的有效作用浓度。1生长因子的分类

根据生长因子产生细胞与接受生长因子作用的细胞相互之间的关系，可概括为以下三种模式：（1）内分泌（endocrine），生长因子从细胞分泌出来后，通过血液运输作用于远隔靶细胞。如：血小板源生长因子（PDGF）源于血小板，作用于结缔组织细胞。（2）旁分泌（paracrine），细胞分泌的生长因子作用于邻近的其他类型细胞，对合成、分泌该生长因子的自身细胞不发生作用，因为它缺乏相应受体。（3）自分泌（autocrine），生长因子作用于合成及分泌该生长因子的细胞本身。生长因子以后两种作用方式为主。2根据作用分类分化调控因子增殖调控因子分化诱导因子：诱导低分化细胞（如干细胞）分化成熟，成为特化功能细胞分化阻抑及去分化因子：阻碍细胞分化和使细胞去分化，变成低分化细胞。增殖促进因子：促进细胞的分裂增殖，使细胞的增殖加快。增殖抑制因子：使细胞的分裂减慢，抑制细胞生长。生长因子的分类3根据产生生物学效应的范围大小分类广谱生长因子：许多生长因子对多种细胞均有作用。如TGF-β对骨、上皮、肌肉等细胞均有作用。窄谱生长因子：少数生长因子只对某一特定类型的细胞产生作用。如BMP只对骨细胞起作用。生长因子的分类4二、生长因子的分类血小板源生长因子表皮生长因子转化生长因子骨形成蛋白碱性成纤维细胞生长因子胰岛素样生长因子结缔组织生长因子神经胶质生长因子血管内皮生长因子根据能产生效应的细胞分类5生长因子的作用方式生长因子的直接作用生长因子的间接作用生长因子的协同作用与拮抗作用生长因子与细胞周期6研究生长因子调控的方法动物体内实验、体外培养实验体内实验观察生长因子作用的指标：缺损愈合时间新生组织的干、湿重及比值组织总蛋白与DNA及RNA含量测定羟脯氨酸含量测定显微镜观察7体外培养实验观察生长因子作用的指标：体内实验是多种组织细胞综合作用的过程。相比之下，体外培养的细胞是单一种类细胞。研究单一生长因子或多种生长因子联合对培养细胞的作用，能够比较客观地反映这些生长因子对该细胞的直接作用，观察指标如下。生长曲线量效曲线细胞周期测定细胞产物测定细胞受体密度及其mRNA测定8几种组织工程常用的生长因子表皮生长因子骨形成蛋白神经生长因子转移生长因子成纤维生长因子912/11/2023五、生长因子的控制释放技术（一）生长因子控制释放的必要性生长因子的存在可促进细胞在支架上的黏附、增殖和生长，为组织工程化组织或器官构建提供一个良好的微环境，从而有利于创伤的修复和组织的再生。在组织工程中的应用主要有两种方式：

将生长因子直接复合到支架材料上或支架构建完成后再进行复合；将细胞移植到支架材料上，由细胞来分泌生长因子。这些细胞可以是自然状态下分泌生长因子的细胞，也可以是经过基因改造的细胞。10五、生长因子的控制释放技术①释放编码生长因子的DNA转染宿主细胞；②基因转染离体细胞并使之在宿主体内表达相关因子③在修复部位直接添加生长因子；④应用控释技术使载体包含的生长因子在体内缓慢释放，在一段时间内持续发挥作用。前两项技术目前尚处在实验室探索阶段，而将各种生长因子施加于治疗区域已获得稳定可靠的效果。1112/11/2023五、生长因子的控制释放技术（一）生长因子控制释放的必要性生长因子优点诸多，但是也存在很多问题，主要是高扩散性和半衰期短，生物学活性难以长期保存。局部直接应用生长因子可在较短的时间内发挥作用，但在生理环境下很容易使之迅速失活，不产生预期的生理效应。因此，如何采用药物控制释放技术，对生长因子进行保护，使之在有水环境下即能保持活性，又能持续释放或控制释放，是使生长因子得到有效应用的关键。1212/11/2023五、生长因子的控制释放技术（二）控制释放技术的应用

药物的控制释放零级释药缓释使药物在需要时间和时间间隔内对需要剂量释放至所需部位，防止药物失活。13五、生长因子的控制释放技术生长因子的控释体系最常见的生长因子的控制释放体系，有骨架型（基体型）和贮库型（贮存型）两种。

骨架型：生长因子以分子或微晶、微粒的形式均匀分散在各种载体材料中。药物的释放速率和释放分布可通过基材的形状、药物在基材中的分布以及高分子材料的化学、物理和生物学特性控制贮库型：生长因子被包裹在高分子聚合物膜内。药物微粒的大小可根据使用的目的调整，粒径可从微米到纳米。14五、生长因子的控制释放技术生长因子的控释模式和负载剂量模式：弥散型、酶反应控制型、溶剂控制型

弥散型：根据蛋白的溶解性高低，在载体和水中的部分比例和因子的负载量决定释放速度。

酶反应控制型：将生长因子包裹在可酶解的载体包壳内，载体材料降解的快慢决定了生长因子的释放速度。

溶剂控制型：将生长因子融入可溶性材料基质中，当水溶液浸入材料内部，因子就随之释放。15五、生长因子的控制释放技术生长因子的控释模式和负载剂量模式：弥散型、酶反应控制型、溶剂控制型

弥散型：根据蛋白的溶解性高低，在载体和水中的部分比例和因子的负载量决定释放速度。例如调节珊瑚人工骨粒径和蛋白吸附条件(pH3、7．4和11，添加0．1BSA或明胶)，可改变TGF-β1的释放速度。16五、生长因子的控制释放技术生长因子的控释模式和负载剂量模式：弥散型、酶反应控制型、溶剂控制型

酶反应控制型：将生长因子包裹在可酶解的载体包壳内，载体材料降解的快慢决定了生长因子的释放速度。例如在小鼠皮下观察胶原包裹TGF-β1的控释效果，发现释放速度由胶原载体的交联度(即酶解速度)决定。

17五、生长因子的控制释放技术生长因子的控释模式和负载剂量模式：弥散型、酶反应控制型、溶剂控制型溶剂控制型：将生长因子融入可溶性材料基质中，当水溶液浸入材料内部，因子就随之释放。生长因子的释放方式，明显影响着其作用效力。在绵羊骨钻孔模型中发现，应用PLGA和PLA装载的IGF-I在直线、脉冲和缓慢控释下可产生截然不同的成骨结果。18五、生长因子的控制释放技术生长因子的控释模式和负载剂量负载剂量：自然状态下，体内仅需少量生长因子就可完成某些成骨过程，但在控释体系中却需要超剂量的投放才能满足需求。19五、生长因子的控制释放技术生长因子的控释模式和负载剂量成骨因子的控释效果存在着剂量依赖性。将PIGA微球包裹的不同剂量IGF-I植入绵羊骨干骺端钻孔内，发现30ug与80ug时形成的新骨量具有明显差异，但将剂量提高到100ug后成骨效果不再继续增加，并保持在与80ug效应相当的水平。实验研究还证实，过量输入BMP-2、IGF-I等会抑制新骨生长，甚至可能导致异位骨化和骨囊肿等肿瘤样病变。此外有研究观察发现，应用控释载体完成相同的成骨过程，啮齿类动物所需rhBMP-2的基本浓度为25ug／ml，犬类为50ug／ml,而灵长类动物和人类则分别为80ug／ml和100ug／ml。然而在自然状态下，仅2ng／g的BMP-2生理浓度即足以确保骨修复的完成。2012/11/2023五、生长因子的控制释放技术（三）生长因子控制释放载体材料

天然的可降解材料

明胶、纤维素、蛋白质、羟基磷灰石、珊瑚…….

人工的可降解材料

聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚几内酯……2112/11/2023五、生长因子的控制释放技术（四）生长因子控制释放体系

高分子微包囊水凝胶脂质体纳米控释载体其他控释体系22五、生长因子的控制释放技术（四）生长因子控制释放体系

高分子微包囊:通过成膜物质将囊内空间和囊外空间隔离开以形成特定的几何结构的物质。

23微胶囊的不同结构图24

空气悬浮法、喷雾干燥法、喷雾凝冻法、物理法真空蒸发沉积法、静电结合法、包结络合法、多孔离心法、界面聚合法、原位聚合法化学法分子包囊法、辐射包囊法水相分离法、油相分离法、孔膜挤压法、物化法熔化分散法、粉末床法、囊心交换法、锐孔-凝固浴法、复相乳液法(干燥浴法)微胶囊化的方法25凝聚法：芯材分散——壁材包覆囊材（明胶）和囊心物质（生长因子）→混悬液或乳浊液（油/水）→加入壁材（阿拉伯胶）→凝聚→沉降→固化→微胶囊产品2612/11/2023五、生长因子的控制释放技术（四）生长因子控制释放体系水凝胶，常用的生长因子基体型释放体系。常见的水凝胶有聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇、聚环氧乙烷或聚乙二醇等合成材料及一些天然水凝胶2712/11/2023五、生长因子的控制释放技术（四）生长因子控制释放体系脂质体：是磷脂分散在水中形成的球状的、包封一部分内水相的封闭囊泡。一般粒径为0.05-0.5um。可形成脂质体膜材料的类脂类物质有卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、豆磷脂等。

28在脂质体表面，脂质分子的亲水基富集。利用脂质双分子膜的外层和内层性质不同，可用来控释各种生理活性物质固脂质体可生物降解，易于制备，而且能负载许多脂质和水溶性药物，固脂质体是有效的药物载体2912/11/2023五、生长因子的控制释放技术（四）生长因子控制释放体系纳米控释载体

靶向纳米微球3012/11/2023五、生长因子的控制释放技术（四）生长因子控制释放体系其他控释体系胶束电纺丝超纤维体系基因载体控释系统将生长因子的基因借助病毒或非病毒载体转入细胞，能使细胞持续分泌生长因子，从而促进细胞增殖、分化和迁移等，称为基因载体控释系统。31五、生长因子的控制释放技术（五）存在问题“突释效应”造成早期大量给药生长因子的活性不能持久地保持多因子控释和靶向控释策略有待进一步优化控释结果的评价缺乏客观标准32六创伤修复中多种因子的贯序作用创伤→启动凝血→活化血小板→释放血小板生长因子(PDGF)、转移生长因子(TGF)→趋向作用，吸引大量细胞，如巨嗜细胞、成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞等→每种细胞都分泌相应自己的生长因子(TGF-β、

TGF-α、PEGF、TNF)→生长因子大量释放，迅速扩散，蛋白酶降解→其他细胞趋化作用→在创伤面上分泌许多生长因子与细胞外基质，细胞外基质对生长因子即起储存作用又起促进作用→新的生长因子促进细胞局部增生→产生成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞→形成纤维结缔组织、瘢痕→胶原酶降解过量胶原消除瘢痕→修复完成33六创伤修复中多种因子的贯序作用骨受损→启动凝血→活化血小板→释放血小板生长因子(PDGF)、转移生长因子(TGF)→激活成骨细胞骨受损组织→释放BMP→诱导骨原细胞→分化为成骨细胞骨组织本身受到破坏→释放生长因子→激活成骨细胞成骨细胞趋化迁移至骨吸收部位自分泌、旁分泌2天后表达BMP7-12天(1-2周)后表达PDGF、TGF、FGF反馈成骨细胞促进分裂、增殖，合成骨基质34

第七章骨组织工程35主要内容人体骨骼的基本组成结构及功能骨的生长与发育骨组织工程的细胞骨形成的生长因子成骨细胞的细胞社会学特性组织工程化人工骨的临床应用36人体骨骼的基本组成结构及功能37人体骨骼的基本组成结构及功能骨的正常结构与其他结缔组织基本相似，也由细胞、纤维和基质三部分组成。按其发生和组织成分来看，属于结缔组织。骨组织最大特点是细胞间质具有大量的钙盐沉积，成为人体中最硬的组织之一，从而发挥其支架作用。3839人体骨骼的基本组成结构及功能骨的成分（1）有机物：主要是骨胶蛋白，使骨具有一定的韧性。（2）无机盐：主要是骨盐（主要是碱性磷酸钙），使得骨坚硬不屈、傲然挺立，是影响骨的硬度的因素。40骨胶纤维：占有机质90%,由Ⅰ型胶原蛋白组成基质钙结合蛋白—参与骨的钙化并调节骨的吸收骨粘连蛋白骨桥蛋白与细胞和骨基质的粘合有关，也调节骨的钙化有机质（类骨质）无机质：(骨盐)主要为羟基磷灰石结晶，细针状结晶41人体骨骼的基本组成结构及功能将骨浸泡于稀盐酸中,经一段时间后,骨变得柔软。这是因为骨成分中的无机物溶解于盐酸中,剩下的是骨胶原；将一段骨放到酒精灯上煅烧至灰白色,轻敲这段骨便粉碎.这是因为骨中的有机物燃烧掉后,剩下的是脆而硬的无机物。42人体骨骼的基本组成结构及功能有机和无机两种成分有着恒定的比例，一般而言，前者占成人骨干重的34％，后者占65％。使骨有一定的硬度和弹性。43人体骨骼的基本组成结构及功能人的一生不同时期骨中不同成分的含量及其物理特性人的一生中骨的成分是不断变化，儿童少年之所以能够长高，与骨的生长有密切关系；老年人之所以容易发生骨折，与骨的成分有关系。44人体骨骼的基本组成结构及功能骨的结构1．骨膜：营养、新生、感觉（成骨细胞：能使骨增生和骨折后再生）2．骨质分骨松质和骨密质3．骨髓（1）红骨髓：具有造血功能。（2）黄骨髓：失去造血功能。45骨（模式图）骨组织骨髓骨外膜—骨膜

—骨髓腔骨内膜——46纤维层：最外面，薄而致密，排列不规则的致密结缔组织，其中含有一些成纤维细胞。结缔组织中含有较粗大的胶原纤维束，彼此交织成网状，有血管和神经从中穿行。由致密结缔组织组成骨外膜骨内膜：一薄层含细胞的结缔组织，除衬附在骨髓腔面以外，也衬附在哈弗管内及包在松质骨的骨小梁表面，骨内膜中的细胞也具有成骨和造血功能。新生层（成骨层）：内：由多功能的扁平梭形细胞组成，含较多的弹力纤维，形成一薄层弹力纤维网骨膜

人体骨骼的基本组成结构及功能47骨原细胞——骨外膜——骨祖细胞————骨组织——————骨髓腔48骨质密质骨松质骨：又称皮质骨，为内含许多相互连通的小管道及血管神经的规律排列的骨板。见于长骨的骨干和扁平骨的表层。：由大量针状或片状的骨小梁相互连接而成的多孔网架结构，网孔中充满骨髓。人体骨骼的基本组成结构及功能骨质49—骨外膜

——外环骨板—血管内环骨板———骨内膜——哈弗骨板—中央管—

中央管———————————穿通管————间骨板骨干（模式图）—神经骨单位50骨密质环骨板

内环骨板(external

circumferentiallamella)外环骨板

(internal

circumferentiallamella)骨单位：

10—20层骨板呈同心圆排列，中轴有一中央管。

间骨板(circumferentiallamella)

人体骨骼的基本组成结构及功能51外环骨板内环骨板52①内环骨板②骨单位53外环骨板层表面的骨板环绕骨干排列，称为外环骨板层，由数层骨板构成，其外与骨外膜紧密相连。其中有与骨干相垂直的孔道，横向穿行于骨干，称为伏克曼管，通过伏克曼管，营养血管进入骨内，和纵向走行的哈弗管内的血管相通。5455①骨陷窝②哈弗斯管③福克曼氏管④间骨板⑤粘合线56①骨陷窝②哈弗斯管③骨小管④粘合线57骨由外向内：骨膜---外环骨板层---哈佛系统---内环骨板层---骨松质---骨髓人体骨骼的基本组成结构及功能58骨组织细胞骨细胞成骨细胞骨原细胞破骨细胞

人体骨骼的基本组成结构及功能59骨组织的细胞骨原细胞：是骨组织中的干细胞，位于骨组织和表面。细胞胶小，呈不规则的梭形，胞质少，呈嗜碱性，细胞器少。能分化为成骨细胞。成骨细胞：位于成骨活跃的骨组织表面，常成行排列于骨片表面，细胞呈矮柱状或呈扁平状，细胞核椭圆形，细胞质嗜碱性。可转化为骨细胞。60成骨细胞———成骨细胞—————骨组织61骨组织的细胞骨细胞：单个分散于骨板之间或骨板之内。细胞较小，呈扁卵圆形，有许多细长突起，胞质弱嗜酸性碱性，细胞器相对地少。骨细胞体在骨基质所占据的空间称骨陷窝；骨细胞的突起以缝隙连接相连，骨管彼此连通，骨陷窝和骨小管内含组织液，可营养骨细胞和输送代谢产物。分泌骨胶纤维和基质。对基质的更新和维持维持血钙的恒定有重要作用。62————骨细胞————————骨陷窝骨细胞和骨陷窝6364骨细胞电镜结构模式图65基质小泡膜上有碱性磷酸酶、焦磷酸酶、ATP酶、酸性磷脂泡内含钙、小骨盐结晶、钙结合蛋白类骨质基质小泡钙化成骨细胞类骨质包埋后骨细胞66

破骨细胞：位于新生骨片的边缘，细胞很大，直径100um，呈不规则形，有多个细胞核，细胞质强嗜酸性。贴近骨基质一侧有许多不规则的微绒毛称皱褶，在皱褶周边有一环形胞质区称亮区，内含许多微丝。在皱褶缘基部有溶酶体、吞饮泡。功能：有溶解和吸收骨基质的作用；分泌有机酸产生氧自由基增强溶液骨作用。骨组织的细胞67破骨细胞——骨组织

———破骨细胞

————细胞核

————皱褶缘68破骨细胞的皱褶缘69骨的生长与发育70骨组织的形成骨组织的分解和吸收骨的发生膜内成骨软骨内成骨骨的生长和改建骨的修复骨移植中移植骨的归宿和新骨的生成移植骨的转归骨移植后新骨形成的成因影响骨生长发育的因素711.骨组织形成骨组织发生处血管增生，间充质细胞骨祖细胞成骨细胞纤维、基质(类骨质)钙盐骨基质(自埋)骨细胞骨组织72骨组织形成———骨细胞骨原细胞间充质———成骨细胞732.骨组织的分解吸收破骨细胞分解吸收骨组织74骨组织分解吸收——破骨细胞——骨组织75骨组织形成骨生长、改建（交替进行）+骨组织分解吸收76骨的发生方式1.膜内成骨2.软骨内成骨间充质胚胎性结缔组织膜骨(顶骨)间充质软骨骨(长骨)771，膜内成骨1）骨发生处血管增生间充质细胞骨祖细胞成骨细胞纤维、基质(类骨质)自埋骨细胞钙盐骨基质骨组织改建胚性结缔组织膜初级骨松质骨化中心78膜内成骨（顶骨为例）——血管———间充质细胞——胚性结缔组织膜79膜内成骨———骨细胞骨原细胞间充质———成骨细胞80

——————成骨细胞膜内成骨——————破骨细胞81顶骨的生长与改建————外表面以成骨为主———内表面以分解吸收为主曲度82膜内成骨三、四个月胎儿之顶骨，石蜡切片，H·E染色1.骨膜：在标本两侧，为致密结缔组织。2.新生骨片：大小不等、形态不一、着色较红，可见其表面有成行排列的成骨细胞。骨片之间有疏松结缔组织和血管。3.成骨细胞83膜内成骨①成骨细胞②骨陷窝及骨细胞③骨原细胞842，软骨内成骨（长骨的发生）透明软骨—软骨膜

——软骨组织间充质（骨祖细胞）（1）.软骨雏形形成85（2）.骨领形成—骨领

—骨膜（骨外膜）初级骨松质（骨领）（骨细胞）软骨雏形中段外周（骨祖细胞-成骨细胞）86（3）.软骨内骨化初级骨化中心形成Ι，软骨退化软骨中段软骨细胞肥大死亡基质钙化软骨退化①87软骨退化———软骨基质钙化———骨领———软骨细胞（肥大、死亡）——骨膜88Ⅱ，初级骨化中心及初级骨髓腔形成血管破骨细胞间充质退化软骨区初级骨髓腔成骨细胞软骨残基表面造骨骨祖细胞过渡型骨小梁分解、吸收钙化软骨基质（先出现处为初级骨化中心）89血管、破骨细胞、间充质进入血管————破骨细胞间充质90初级骨髓腔的形成初级骨髓腔—————破骨细胞91初级骨髓腔—————软骨残基——————破骨细胞———————成骨细胞——过渡型骨小梁92②骨髓腔形成：破骨细胞溶解物吸收过渡性骨小梁，将初级骨髓腔融合成为较大的腔即骨髓腔，并随着初级骨化中心成骨过程而扩大93③次级骨化中心形成骨干两端

次级骨化中心-骨组织填充-骨骺中央-四周骨化骺板：骨骺与骨干之间保留的软骨层关节软骨：骨骺表面保留的软骨层94——次级骨化中心骨骺——骨骺————关节软骨———骺板骺线95④骨的加长和增粗Ι，加长：骺板不断生长---经过四个不同阶段(区）--成骨组织96加长：成骨活动四区软骨储备区软骨增生区软骨钙化区成骨区软骨骨髓腔97成骨活动四区98软骨储备区软骨细胞小，散在基质弱嗜碱性99软骨增生区软骨细胞柱——————100软骨钙化区101成骨区102Ⅱ，增粗：骨外膜骨祖细胞-成骨细胞-骨组织骨干内部：破骨细胞吸收骨小梁-骨髓腔扩大103骨的修复骨折：局部血管断裂，形成血块，骨折附近的骨基质破坏，骨细胞死亡骨修复：血块被肉芽组织机化，肉芽组织转变成致密纤维结缔组织。纤维软骨痂，软骨内成骨。膜内成骨。原始骨痂转变成永久骨痂。104骨的修复与重建

（一）血肿机化期骨断裂后，髓腔内，骨膜下和周围软组织内出血，形成血肿，血肿于伤后6－8小时即开始凝结成含有网状纤维的血凝块。骨折端由于损伤和局部血液供应断绝，有几毫米长的骨质发生坏死。断端间、髓腔内的血肿凝成血块。它和损伤坏死的软组织引起局部无菌性炎症反应。新生的毛细管和吞噬细胞、成纤维细胞等从四周侵入，逐步进行消除机化，形成肉芽组织。转化为纤维组织。这一过程约需2～3周方能初步完成。105骨的修复与重建

（二）原始骨痂形成期由骨内、外膜的骨样组织逐渐钙化而成新生骨，即膜内化骨。两者紧贴在断端骨皮质的内、外两面，逐渐向骨折处汇合，形成两个梭形短管，将两断裂的骨皮质及其间由血肿机化而成的纤维组织夹在中间，分别称为内骨痂和外骨痂。106骨的修复与重建

（三）骨痂改造塑型期原始骨痂为排列不规则的骨小梁所组成，尚欠牢固，应防止外伤，以免发生再骨折。随着肢体的活动和负重，在应力轴线上的骨痂，不断地得到加强和改造；在应力轴线上以外的骨痂，逐步被清除；使原始骨痂逐渐被改造成为永久骨痂，后者具有正常的骨结构。骨髓腔亦再沟通，恢复骨之原形。小孩为1～2年，成人为2～4年。107骨移植中移植骨的归宿和新骨的生成骨移植：用手术方法将各种骨组织移植到患者体内的骨缺损区、须加强或融合的部位，目的是起到固定、促进骨形成和替代的作用。自体骨移植、同种骨移植、异种骨移植、人工骨移植。带血管蒂骨移植。移植骨的转归骨移植后新骨形成的成因108移植骨的转归移植骨：坏死而被重吸收，通过“爬行替代”形成新骨；人工骨：被吸收后由新骨替代；带血管蒂骨移植：类似正常骨折的愈合过程。109骨移植后新骨形成的成因

成骨细胞学说：新骨来自移植骨中的成骨细胞爬行替代学说：移植骨坏死被吸收骨诱导学说：释放BMP，诱导成骨骨移植后新骨形成须具备三个条件：有可以生骨的细胞、足够的营养供应、适当诱发产生新骨的刺激。110影响骨生长发育的因素激素的影响骨生长因子的影响维生素的影响物理因素的影响111骨组织工程112成骨细胞是骨组织工程的关键细胞，成骨细胞合成和分泌I型胶原，并在I型胶原上形成钙、磷结晶，完成骨基质的矿化过程，自身最厚包埋在骨陷窝中，转变成骨细胞。成骨细胞增殖能力强。有很强的成骨能力，植入体内能较快形成新骨代替支架材料。对成骨细胞的分离培养、扩增和功能的调控是骨组织工程研究关键。骨组织工程细胞113骨组织工程细胞1.成骨细胞的组织来源2.不同来源成骨细胞的培养方法3.成骨细胞的生物学特性114成骨细胞的组织来源骨髓、骨膜、颅顶骨、髂骨等松质骨。现在已从大鼠、小鼠、兔、鸡、牛及人的胚胎、幼年及成年个体中培养相应的成骨细胞。115不同来源成骨细胞的培养方法骨髓基质干细胞的培养采用穿刺抽吸骨髓或去除骨端冲洗出骨髓，离心后去细胞进行培养。骨膜和松质骨来源的成骨细胞：组织块培养法、酶消化培养法。注意去除成纤维细胞的污染。116三种细胞各有优点三种细胞各有优点：骨髓：取材方便，对供体损伤小，可反复抽吸；骨髓基质干细胞为条件成骨细胞，需要适当的诱导因子，成骨量少，原代培养时获得的有效细胞数量少，须较长时间体外培养；骨膜和松质骨来源的成骨细胞具有原代细胞数目多，易定向分化为成骨细胞，成骨能力强，但是取材时对供体有伤害，来源受限，增殖能力不如骨髓基质干细胞。117成骨细胞的生物学特性成骨细胞的主要功能：合成、分泌骨基质并促进基质矿化形成骨组织。体外培养的成骨细胞表现为增殖态和功能态2种相对状态。118（一）成骨细胞与细胞外基质的关系（二）成骨细胞与血管内皮细胞的关系（三）成骨细胞与破骨细胞的关系（四）成骨细胞与骨细胞的关系成骨细胞的生物学特性119（一）成骨细胞与细胞外基质的关系ECM具有连接、支持细胞、组织的作用。ECM成分复杂多样，一方面，细胞与ECM的粘附是细胞迁移、增殖、分化的基础。另一方面，细胞与ECM的粘附还与胚胎发育、伤口修复、肿瘤转移、炎症反应等密切相关。许多胞内信号传递，都与细胞-ECM的粘附密切相关。120细胞与ECM通过膜上的特异性受体-整合素介导联系。整合素介导的成骨细胞与ECM的粘附对成骨细胞的功能活动起重要的调节作用。成骨细胞的ECM主要有无机成分（磷酸钙，增强骨组织的力学强度）和有机成分（I型胶原等）。构建支架材料时，要求：理想的力学强度，结构和功能接近自然骨，为成骨细胞的活动提供理想环境，并通过I型胶原等组分对成骨细胞的增殖、分化进行调控。121（二）成骨细胞与血管内皮细胞的关系骨脉管系统在骨发育、改建和修复过程中作用重要。成骨和血管化不可分割，成骨细胞总是和血管床的内皮细胞紧密相邻，二者在功能上互相影响。血管内皮细胞可合成和分泌一系列可溶性调节介质，包括生长因子和细胞因子，这些因子具有控制骨细胞聚集、增殖、分化等作用。内皮细胞是由间充质来源，和骨髓紧密接触，与骨髓具有共同的抗原，因而被认为有可能直接分化为成骨细胞和造血干细胞而参与骨发育。成骨细胞能分泌促血管形成因子，作用于内皮细胞，促进血管形成。122构建组织工程化人工骨时，如何实现人工骨的体内血管化是关键技术之一。人工骨的快速血管化可为成骨细胞功能活动提供充足的营养成分，决定成骨量的多少；只有完成了人工骨的血管化，人工骨才能演变为自体骨，在体内发挥持久的生理功能。123构建组织工程化人工骨在支架内部预值这种内皮细胞的人造血管，植入体内时与自体血管吻合；在支架材料上进行血管内皮细胞的三维培养，使血管内皮细胞长入材料内部，植入体内时这些内皮细胞作为种子诱导整个材料发生毛细血管化。124（三）成骨细胞与破骨细胞的关系成骨和破骨对立统一。成骨细胞的成骨可以不断形成新骨，破骨细胞的破骨活动对新骨不断改造，动态平衡。成骨细胞是关键，破骨细胞的启动因子来源于成骨细胞，细胞因子、激素通过成骨细胞调节破骨细胞的活力，从而调节骨吸收活动；破骨细胞也分泌一些细胞因子影响成骨细胞的功能活动。植入早期，成骨正调控，破骨负调控；后期，对成骨进行负调控，破骨正调控，使人工骨上沉积的新骨不致过量，尽早完成人工骨改建。125（四）成骨细胞与骨细胞的关系成骨细胞转换为骨细胞126（一）与骨形成有关的其他生长因子1.血管内皮细胞生长因子2.肿瘤坏死因子3.白细胞介素-1(二)生长因子的作用机制