分子生物学学习资料：chapter5

5.1用图来解释DNA电泳的原理。简要地说明150，600和1200个碱基对的DNA的相对迁移率。答：电泳来分离DNA是利用了DNA本身带有负电，所以在电泳池中朝向正极移动。根据DNA碱基对的数目不同，即分子量的大小差异，小分子的DNA所受到的摩擦力相对小，于是电泳迁移率较快。大分子DNA会受到较大的摩擦，速率相对较慢。根据分子量的大小，就可以分离出不同大小的DNA片段：大分子DNA靠近顶端，小分子DNA靠近底部。最后，DNA用荧光染料染色，电泳结果既可显现。根据电泳结果和一个已知的Ladder比较（如图所示），即可以粗略得到片段大小。在一定范围内(0~1000bp)，移动的距离和碱基对的数目基本呈正比。记移动距离为λ。故一般满足如下：λ150=4λ600。但是1200个碱基时，稍微偏离线性，但是偏差不大。故不严格追究应也有λ600=2λ1200。实际上前者略小于后者的两倍。5.2一个特定的双链DNA片段在图5.2b所示电泳实验中迁移了30mm，估算其碱基对大小。答：从图上可知片段长度大约为550个碱基对。5.3请比较蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和二维电泳。答：SDS可以分离不同分子质量的多肽，SDS有两个优点：首先它可以作为一种detergent去使subunits变性，这样subunits就不会互相结合在一起；其次，它可以使所有的peptides带上负电，同时它可以掩盖peptides自身的电性。这样，在电泳中，我们可以仅仅根据多肽的分子质量去分离不同的多肽，而不用去但多肽自身电性对电泳的影响2D-gelelectrophoresis是一种能力更为强大的用来分离多肽的方法，操作过程可分为两步：第一步是isoelectricfocusing，蛋白混合物将根据它们的PI（(isoelectricpoint)值分离开来；第二步是SDS，在上一步中被初步分离的蛋白将在这一步中得到更加精细的分离。5.4叙述离子交换层析的原理。利用图表举例说明使用该方法对三种不同蛋白质的分离。答：离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡例子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合与电荷基团上的相反离子，它能与溶液中的其他离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂：平衡离子带负电的离子交换剂能与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某些离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，平衡离子进入流动相。以阴离子交换剂为例，简述分离过程。阴离子交换剂装柱平衡后，与缓冲液中带负电的平衡离子结合。加样后，样品中的负电基团与平衡离子进行可逆置换，结合在离子交换剂上。正电基团和中性基团随流动相流出而去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液（如增加离子强度的梯度洗脱），随着离子强度的增加，洗脱液中的离子逐步将结合在离子交换剂上的各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，与离子交换剂结合力大的需要较高的离子强度才能被置换。这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大逐步被洗脱下来，达到分离的目的。利用离子交换层析技术对三种蛋白质A，B，C（A，B，C的A280值大小顺序：B>A>C）进行分离。BCABCA10203040501020304050流出液管号流出液管号FFigure5.4离子交换层析离子交换剂装柱并用缓冲液平衡后，加入含有蛋白质A、B、C的样品，加入洗脱液按离子强度由低到高的顺序梯度洗脱并用部分收集器收集流出液。测量各流出组分在280nm波长下A280值及离子强度。画出图线如上。可以明显得看出有三个峰。由吸收峰值大小可知从左到右每个峰对应组分分别含A，B，C。每个峰对应流出液只含一种蛋白质，并已确定。由此将A，B，C分离。5.5请描述凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)的原理。用一个图来举例说明使用凝胶过滤层析来分离三种不同的蛋白质的过程。在图上标出分子量最大的和最小的蛋白质。答：凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。用凝胶过滤层析分离三种蛋白质的过程如图5.5所示。Fig.5.5用凝胶过滤层析分离三种不同的蛋白质过程示意图5.6对照比较放射自显影技术和荧光成像技术的原理，哪种方法提供的定量数据更多？答：荧光成像技术可以提供的定量数据更多。放射自显影技术是一种通过摄像感光乳剂来检测放射性物质的技术。DNA凝胶电泳过后，使胶层接触X射线薄膜，置于暗处几个小时、或是几天。DNA放出的辐射使胶层曝光，因此当胶层显影后，与DNA带相应的黑带就出现了。我们可以用一种“加厚屏”来提高放射自显影技术的敏感度。它与一种化合物结合，这种化合物在低温下受β射线激发后可以发出荧光。因此我们可以把具有放射性的胶层放在荧光成像薄膜的一面，把加厚屏放在另一面。直接用β射线曝光薄膜，这些高能电子打在屏上就会引起荧光反应，并被薄膜检测到，而如果没有加厚屏射线就会直接穿过。但是如果我们想测量DNA片段的精确放射能呢？首先可以通过观察放射能成像带的亮度进行粗略估计，也可以用显像密度计扫描放射能成像获得进一步的估计。显像密度计使一束光通过放射能成像，测得其对光的吸收。如果带很深，说明它吸收了大部分光线，显像密度计记录到一个很高的吸收峰；如果带很模糊，则说明大部分的光线都穿过去了，显像密度计只能记录到一个很小的吸收峰。通过计算每一个峰下包括的面积，我们可以估算每条带中的放射能。但这仍非计算放射能的直接方法。而要真正得到每条带中的精确放射能，我们要用荧光成像仪扫描胶层。与标准的放射自显影技术相比，荧光成像技术有很多优点，其中最重要的，是它在定量物质中所吸收的放射能方面更为精确，因为它对于放射能的反应比X射线薄膜更接近线性。在标准放射自显影技术中，一条每分钟辐射衰变50000次（50000dpm）的带看起来和10000dpm的一样深，因为在10000dpm时，胶层中的射线就已经饱和了。但是，荧光成像仪检测放射射线，并电子性的分析它们，因此10000dpm和50000dpm之间的区别就很明显了。下面简述荧光成像仪是如何工作的：将与示踪探针杂交的DNA放射样品放置于吸收β射线的平皿里，这些射线激发平皿的分子，然后这些分子一直保持着激发态，直到荧光成像仪用激光扫描平皿。这时，被盘子困住的β射线能量释放出来，并受电脑控制的探测仪监控。电脑将检测到的能量转化一张图片，不同的颜色即代表不同程度的放射能。5.7请描述在电泳胶中探测特定核酸片段的非放射性方法。答：常规使用的主要有以下两类：荧光标记探针和酶标记探针。荧光标记探针技术：(1)荧光探针TaqMan技术（线形探针）：反应原理为在常规PCR的一对引物外，添加一个荧光双标记的寡核苷酸探针，该探针能与引物扩增片断中的某一区域特异性结合。探针5′端带有报告荧光集团，3′端带有淬灭荧光集团，当它们共连于探针上时，其距离较近，淬灭集团会吸收报告集团的激发荧光，使仪器测不到激发荧光；当引物沿模板延伸至探针结合处，探针被分割切下，报告荧光脱离淬灭荧光的控制，而释放出荧光，仪器就能检测到荧光。随着模板数量的增加，结合到模板上的探针也增加，被引物延伸过程中Taq酶切割下探针的数量也增加，报告荧光释放的荧光量也增加，样品中模板的数量与荧光强度成正相关，因此不仅能判断出样品结果的阳阴性，还能定量测定。(2)分子信标荧光PCR技术（环形探针）：反应原理是1996年Tyagi等提出“分子信标”概念，“分子信标”为一环形发夹型探针，其环状部分与靶序列互补，位于主干部分的5′和3′端分别标记报告荧光和淬灭荧光。正常时，发夹呈环形关闭状态，报告荧光和淬灭荧光相距很近，报告荧光被淬灭；PCR扩增时，探针与模板杂交，发夹展开，报告荧光和淬灭荧光拉开，而释放荧光。即在退火时测定荧光，荧光强度与扩增产物成正比。(3)双色荧光探针技术：反应原理是在同一反应管同内加入针对沙眼衣原体、淋球菌两种核酸模板的引物和探针。同时在这两种探针的5′端分别标有不同波长的报告荧光。当探针被分割切下时，报告荧光释放荧光，荧光测定仪器分别收取二种波长的报告荧光释放的荧光信号，进行分析并分别给出二个试验结果。单纯检测淋球菌PCR，结果不可靠，但当沙眼衣原体PCR反应呈阳性时，淋球菌PCR反应阳性就有一定的参考意义。因此，本次申报的几种淋球菌试剂盒中，只通过此种双色双检沙淋荧光探针试剂盒。酶标记探针杂交技术：酶标记探针杂交技术依固相载体不同，主要分微孔板法和膜法。(1)PCR-ELISA（微孔板法）：反应原理是该方法先将引物生物素标记，获得5′端生物素标记的扩增产物。检测时，将扩增产物变性成单链，在微孔板上与已包被好的探针进行特异的核酸杂交，然后产物5′端标记的生物素与酶标记的生物素结合，进行生物素—亲和素—HRP显色。使用酶标仪判读，可行半定量测定。该法引入核酸杂交，提高了检测的特异。(2)PCR杂交梳技术（膜法）：反应原理是将特异的探针点在膜的上端，并固定；带生物素标记的引物通过扩增，使5′端产物带有生物素标记；当膜浸入含扩增产物液体中，5′端带生物素标记的产物随液体向上渗透，与膜上固定的探针杂交；再浸入含亲合素－碱性磷酸酶的溶液中，生物素与亲和素结合，形成生物素－亲合素－碱性磷酸酶；再浸入酶底物液中，通过酶与底物反应，显色蓝点，判断阳性。该法特点操作简便，肉眼判读，无须酶标仪判读，无须洗板机洗涤。5.8用图表示用Southern印迹检测一目标DNA的流程，并与Northern印迹作比较。答：Southern印迹是鉴定特定DNA片段的有效方法，流程图如图：首先，在琼脂凝胶中电泳DNA片段，再用碱液使DNA变性并将单链DNA转移至硝酸纤维素膜或类似材料，然后杂交上标记的探针，用放射自显影或磷光成像技术检测标记带。Northern印迹也是利用碱基互补的原理进行杂交，不过Northern印迹检测的是RNA而不是DNA。其基本过程是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到尼龙膜等固相载体上，用放射性同位素标记的DNA或RNA特异探针对固定于膜上的mRNA进行杂交，洗膜去除特异性杂交信号，经放射自显影，对杂交信号进行分析，与Southern印迹基本相同。Fig5.8Southern杂交流程示意图。5.9描述一个使用小卫星探针的DNA指纹方法。并与现代法政DNA鉴定方法比较，这种方法使用的是探测单个不同DNA位点的探针。答：小卫星指的是一段重复的DNA序列。人类基因组中有大量的重复片断，即小卫星。然而，每个人的重复情况以及片断个数都是不同，就好像人类的指纹，因此，这种小卫星被称为DNA指纹。而DNA指纹法就是利用这种小卫星而实现的。首先，利用限制性内切酶把长链的DNA分子切成小片断，，在已知小卫星的情况下，选择不会切开小卫星的酶。然后，用过电泳将DNA分子分离，变性，用标记过的探针杂交。最后，通过X光曝光显影而找到标记的DNA。由于每个人的小卫星不同，因此得到的显影像也是因人而异，独一无二，因此可作为识别检测工具。比较：前者的对象比较复杂，得到的条带比较多，而不便于识别与分析。但是信息比较全，对于确定罪犯有极大的准确性。后者则比较简单，它是针对DNA的一个单独位点，得到的条数也比较少，方便辨认与比对。此外，由于每一个探针做作的对比筛选比较低，故须一组中使用多个探针，以提高其筛选比而达到单一配对的准确性。当然，理论上后者依然没有前者的准确性高5.10我们能从Northen印迹中获得怎样的信息？答：Northernblot类似于Southernblot，但是他分离的是RNA而不是DNA。在印记上的RNA可以被特异的有标记的探针结合，从而被确认。每条带的强度可以显示RNA的具体有关数量。我们能获得的主要信息是测量基因丰度。更多的具体的信息有：1)你能知道基因都在哪里进行了表达。2)你能知道每条RNA带的大小。3)你能知道基因X副本的丰富程度。电泳带包含的RNA越多，与其能杂交的探针，从而电泳带的颜色越深5.11简单描述荧光原位杂交法。且说明什么情况下选用荧光原位杂交法，而不用SouthernBlotting？答：荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是一种重要的非放射性原位杂交方法，用特殊的荧光素标记DNA探针，在染色体、细胞或组织切片标本上进行DNA杂交，以检测细胞内DNA或RNA特定序列是否存在。其基本原理是利用两条核苷酸单链片段在适宜的条件下能和过氢键结合形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双键分子的特点，用带有标记的DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸(DNA或RNA)片段进行杂交，然后在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。与Southern印记相比，原位杂交术的特点在于可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。若待测DNA或RNA不适合于外位检测（如使用Southern印记）的话，可以使用该方法进行检测与定位。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。近年来随着FISH所应用的探针种类的不断增多，FISH技术不仅应用在细胞遗传学方面，而且还广泛应用于肿瘤的诊断、基因定位等。5.12比较DNA测序的Maxam-Gilbert法与Sanger末端终止法。答：Sanger等(1977)提出的方法，也称双脱氧末端终止法。实验原理如下：DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧碱基（dA,dT,dC,dG）存在条件下复制时，如果在四管反应体系中分别按比例加入四种双脱氧碱基（ddA,ddT,ddC,ddG），只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端、以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行高分辨率电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。而Maxam-Gilbert方法的具体做法是：1）把待测序的DNA分子变性成单链分子，其5’端用32P进行放射性标记。2）然后把这些单链DNA分于分成4份，每份用一种化学试剂处理DNA片段，每种试剂可使DNA分子在一种碱基的5’端的磷酸二酯键处发生断裂，如：用DMS、哌啶先后处理DNA以除去鸟嘌呤等。把反应条件控制好，使每个DNA分子只发生一次断裂，这样，我们就得到4种反应产物，每种由在一种碱基处发生断裂形成的DNA片段组成。3）把这4种反应产物用聚丙烯凝胶电泳进行分离，两个DNA片段只要相差1个碱基，就可以在这种凝胶中被分成两个条带。4）电泳完成后，用X光胶片进行曝光，最后得到一张由不同条带组成的序列图。从图上就可以读出待测DNA片段的碱基序列。由上述可见，Maxam-Gilbert法由整段DNA开始，Sanger末端终止法一个碱基一个碱基地以待测DNA序列合成互补序列，但最终都需要高分辨率电泳分离长短不一的DNA片段。5.13画出一幅Sanger双脱氧末端终止法测序的放射自显影图，并给出相应的DNA序列。答：测序结果如下图所示：Fig5.13Snager法测序结果图。相应的待测序列为：5’-AGACCGTATCATCTATGATACGGTCT-3’5.14如何将一个手动测序法改造成为自动测序法？答：所谓的自动测序方法，是建立在Sanger的末端终止测序法基础上的。在自动测序方法中，首先也是合成引物与待测的单链DNA分子进行杂交，接着加入DNA合成酶和4种的核苷酸，用于DNA的复制。但是该引物是没有被标记的。接着加入四种ddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTP，并分别用不同颜色的荧光标记，通过PCR扩增，从而得到多种由不同颜色荧光标记的不同长度的DNA片断。接着进行电泳，根据长度不同，得以分离。并且由于ddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTP用了不同的颜色标记，所以用激光按照从大到小的顺序依次检测，同时可以直接识别每条带上的DNA的最后一个核苷酸是什么。接着通过电子计算机，把荧光信号转化为与之相对应的DNA序列，从而可以达到自动测序的效果。流程如下图：Fig5.14自动测序原理及流程示意图。5.16阐释基因定点突变的原理，并列举一个具体的操作方法。答：基因定点突变的最基本想法是能够对序列中特定的碱基进行定向改变或修饰，再通过遗传表达体系得到突变的基因表达产物。目前比较成熟的方法是基于PCR技术的基因定点突变法，其操作过程如下：目标：将质粒目的基因中的酪氨酸TAC改换为苯丙氨酸TTC。主要步骤如下，见图：1）变性质粒体系从而将其双链分开；2）将设计的突变型引物（带有TTC密码子）与所给质粒DNA模板结合。3）通过PCR技术对该引物－模板系统进行扩增。使用的DNA聚合酶必须具有高的耐热性及复制的忠实性，如PfuDNA聚合酶，从而减少复制过程中的错误。4）将通过PCR反应体系得到的DNA用Dpn1进行处理，将野生型的被甲基化的DNA降解。由于PCR的产物是在体外合成的，未被甲基化，因此不会被酶切而保留下来。5）利用所得到的定点突变的DNA转化大肠杆菌。理论上，只有带有定点突变的DNA可以顺利转化。这可以通过对所得质粒DNA克隆进行测序进行检验。Fig5.16基于PCR技术的基因定点突变原理示意图5.17比较S1mapping和primerextension在5’endmapping上的异同点，哪一方法可用于mRNA3答：（1）S1核酸酶图谱技术(S1mapping)：首先，末端标记一段单链DNA（包含有转录起始点）作为探针，与相应的mRNA片段杂交。然后，利用单链专一性的S1核酸内切酶，将RNA-DNA杂合双链两端的单链部分切除，再将RNA-DNA杂合双链在高分辨率电泳中，与已知长度的DNA标准片段一起电泳，得到的DNA片段长度等于标记末端的到转录起始点的距离。S1核酸酶图谱技术可以对转录产物的5’和3’端进行分析，以确定转录的起点和终点。（2）引物延伸法(primerextension)：根据DNA序列，合成一段约20个核苷酸的DNA引物，末端作标记。再利用mRNA为模板，逆转录合成cDNA，到mRNA的5’端第一个核苷酸时合成即终止。通过电泳测定这个引物延伸的DNA片段的长度，就可以知道引物的5’端到mRNA的5’端之间的距离。以上这两种方法中，只有S1核酸酶图谱技术(S1mapping)可以用于确定mRNA的3’端。因为在引物延伸法(primerextension)中，逆转录合成cDNA是从引物的5’端开始，到mRNA的5’端第一个核苷酸时终止。而引物的5’端不一定能和mRNA的3’端配对，所以只能准确确定出引物的5’端到mRNA的Table5.17比较S1mapping和primerextension的不同点使用技术的名称基本步骤主要用途缺点S1核酸酶图谱技术(S1mapping)末端标记一段单链DNA（包含有转录起始点）作为探针，与相应的mRNA片段杂交。利用单链专一性的S1核酸内切酶，将RNA-DNA杂合双链两端的单链部分切除。再将RNA-DNA杂合双链在高分辨率电泳中，与已知长度的DNA标准片段一起电泳，得到的DNA片段长度等于标记末端的到转录起始点的距离。可以对转录产物的5’和3’端进行分析，以确定转录的起点和终点。S1核酸酶在RNA-DNA杂合双链的末端可能会出现一点“咬合”现象，甚至会在杂交物A-T含量较高的地方发生融合。有时S1核酸酶不能完全截断单链区域，所以所获得的RNA-DNA杂合双链可能会比真实长度略长一些。引物延伸法(primerextension)根据DNA序列，合成一段约20个核苷酸的DNA引物，末端作标记。再利用mRNA为模板，逆转录合成cDNA，到mRNA的5’端第一个核苷酸时合成即终止。通过电泳测定这个引物延伸的DNA片段的长度，就可以知道引物的5’端到mRNA的5’端之间的距离。只能确定引物的5’端到mRNA的5不能确定mRNA的3’5.18描述Run-offtranscription的方法。为什么这一方法不能和S1mapping以及primerextension一样应用于体内的转录本的检测？答：首先，先找到一个已知的ＤＮＡ序列，其中要含有你所要研究的目标基因，用一种特定的限制性内切酶将目标基因的转录区域从中切断。然后，使用用放射性同位素标记的核苷酸在体外转录切下的ＤＮＡ片段，从而使其被标记。由于该转录区域已经被从中切断，故聚合酶转录到此时即从ＤＮＡ上脱落，转录因此而中断。最后，由于该切割位点是已知的，所以通过定量转录物的长度就可以知道转录起始点的具体位置。Run-offtranscription是在体外进行的转录，无法获得体内转录信息，但却是获知转录起始点和精确定量转录的好方法。该方法不像S1mapping和primerextention那样在体内，而是在体外进行转录，是由它的原理决定的，Run-offtranscription是由DNA为起点，通过体外转录从而获得转录本的信息，而S1mapping和primerextention是由体内的mRNA转录产物为研究起点，所以获得的是invivo的信息。5.19怎样标记双链DNA分子的5’－末端？3’－末端？答：1）标记5’－末端：标记一般是用含放射性的32P的磷酸基（32P-phosphate）。首先，用碱性磷酸酶（alkalinephosphatase)把DNA5’－末端的磷酸基去掉，然后用多核苷酸激酶(polynucleotidekinase)把[γ-32P]ATP上的32P磷酸基转到5’的羟基上，完成标记。2）标记3’－末端：由于多核苷酸激酶不能使3’－末端的羟基磷酸化，因此标记3’的方法和标记5’的方法有所不同。一般用末端填平（end-filling）的方法标记3’－末端。首先，用一种限制性内切酶（如HindⅢ）剪切DNA使之切割后产生5’－末端突出片段（5’-overhangs），然后用一种DNA聚合酶的片段Klenowfragment把3’－末端填平（将凹进的3’端延伸至与5’－末端一致）。Klenowfragment没有通常的外切活性，不会把5’端的突出片段切除。在末端填平时用放射物标记过的碱基就可以达到标记3’－末端的目的。5.20描述Nuclearrun-onassay，并分析比较它与run-offassay有什么不同。答：在Nuclearrun-onassay中，首先分离提取细胞核，加入heparin用于结合自由的RNA聚合酶来防止它催化新的转录。这样在体外只有已经开始的转录可以在带有标记的底物中继续发生。把对应基因的DNA与标记后的RNA产物进行点杂交，就可以用来在体外确定体内有哪些基因有转录物产生，以及转录强度的大小。Run-offassay是指用限制性内切酶在转录区内的酶切位点切出不完整的基因片段，用标记的核苷酸为底物进行转录。这样RNA聚合酶就会在切点处提前脱离。电泳测定转录片段的长度，就可以用来判断3’端转录起始位置，这样的方法只能用来测定体外转录。5.21点杂交与Southern杂交有何区别?答：点杂交作为一项技术用于确定和探测蛋白质分子或核酸分子。但相对Southern杂交，它没有通过电泳来分离纯化样品的过程，而是直接用样品在硝酸纤维素膜上，与探针进行点对点杂交。相比之下，这种方法操作起来更简便快捷，但是不能通过实验获得基因片段的分子量，而且特异性不及Southern杂交高，同时它需要样品有较高纯度。Southern杂交的原理与点杂交相似，同样用于鉴定DNA分子片段。其过程首先对样品进行电泳，来分离纯化DNA片段，从而得到相应的分子量。而后经变性，使单链DNA在硝酸纤维素膜上与探针进行杂交，从而鉴定所需基因片段。该方法特异性高，能够获得纯度较高的基因片段，且同时可以获得测得分子质量。在实验中，Southern杂交方法更常用，也可以结合两种方法进行核酸分子的鉴定分析。5.22叙述报告基因在测定启动子强度中的应用。答：为了测量启动子活性，我们可以将启动子与报告基因连接起来，组成重组质粒在载体中表达。报告基因一般为编码-galactosidase，CAT（cholramphenicolacetyltransferase），或者luciferase等蛋白的基因，这些表达产物具有易于测定的特点。假定报告基因的表达量可以作为转录速度的合理量度，那么测定特定产物的表达量可以推测启动子的活性。5.23请描述用于测定DNA与蛋白质间相互作用的滤膜结合(filterbindingassay)技术。答：当单链DNA分子通过硝酸纤维素膜时，可以结合到膜上；但是双链DNA分子并不能结合。另一方面，蛋白质分子可以结合到膜上；所以如若蛋白质分子可以与双链DNA结合时，DNA-蛋白质复合物就可以结合到膜上了。在实验具体操作中，我们分别用标记的蛋白质分子和标记的双链DNA分子通过膜，则在蛋白质对应的膜上可以检测到放射性，而在DNA分子对应的膜上则不能。另外用标记的双链DNA分子与蛋白质分子相混合，再通过膜，如果可以检测到膜上有放射性，则很可能蛋白质与核酸分子发生作用而结合。所以，滤膜结合法是一种通过硝酸纤维素膜上的放射性含量来直接测定蛋白质与核酸作用的方法。Fig.5.23滤膜结合技术原理5.24比较凝胶电泳迁移率改变分析（GelMobilityShift）和DNA酶解足迹分析（DNaseFootprinting）这两种方法在检测特殊的DNA-蛋白质相互作用中的异同。DNA酶解足迹分析法可以提供哪些凝胶电泳迁移率改变分析法所不能提供的信息？答：凝胶电泳迁移率改变分析（GelMobilityShift）和DNA酶解足迹分析（DNaseFootprinting）这两种方法在检测特殊的DNA-蛋白质相互作用中的异同见下表（表5.24）。DNA酶解足迹分析法可以检测出DNA与蛋白质结合位点的具体位置并测定出DNA与蛋白质结合部位的DNA序列。而这两点信息是凝胶电泳迁移率改变分析法所不能提供的。Table5.24凝胶电泳迁移率改变分析和DNA酶解足迹分析的异同比较凝胶电泳迁移率改变分析（GelMobilityShift）DNA酶解足迹分析（DNaseFootprinting）应用领域DNA-蛋白质相互作用分析检测原理该方法的基本原理是：同一个DNA分子在和蛋白质结合前后，其凝胶电泳迁移率会有明显改变。具体而言，尚未和蛋白质结合的DNA分子，其分子量较小，因此在凝胶电泳时迁移率很高；而在该DNA分子和蛋白质结合形成DNA-蛋白质复合物之后，由于复合物的分子量较之原来的DNA分子显著增大，所以复合物的凝胶电泳迁移率明显低于原来的DNA分子。该方法的基本原理是：一个蛋白质在和一段DNA分子结合形成DNA-蛋白质复合物之后，可以把两者结合部位的DNA序列保护起来，从而使这段被保护的DNA序列不会被DNA酶切断。这样通过对不同蛋白质浓度下，该段DNA被DNA酶处理后的电泳结果，就可以定为DNA和蛋白质的结合部位，并检测出结合位点的DNA序列。检测过程1.分别准备带有标记的纯净目标DNA和带有标记（如同位素标记）的目标DNA-蛋白质复合体。（也可以制备带有标记的DNA-蛋白质-抗体复合体，同时进行凝胶电泳，这样可以得到DNA-蛋白质-抗体复合体的超迁移率，即Supershift）2.对样品进行凝胶电泳，并利用放射自显影技术或者其他标记技术显示出不同样品的电泳条带。3.根据凝胶电泳中DNA-蛋白质复合物样品的迁移距离相对于原始DNA分子的改变量（即MobilityShift）获得DNA和蛋白质相互作用的信息。1.标记双链目标DNA的一条链。2.使目标DNA与蛋白质结合（可选用多种不同的蛋白质浓度梯度）3.用DNA酶=1\*ROMANI（DNase=1\*ROMANI）对目标复合物进行酶解，控制酶解得条件使得每个DNA分子只会被DNA酶切断一次。4.使DNA与蛋白质分离。5.使DNA分子变性。6.对所得到的单链DNA进行电泳（用同位素标记须进行放射自显影以显示电泳结果）。7.比较不同蛋白质浓度下的电泳结果，以检测DNA与蛋白质的结合部位。8.为了获得结合位点的DNA序列，需要对目标DNA进行测序（如双脱氧核糖核酸法），通过测序的结果与酶解足迹分析结果的对应关系确定DNA-蛋白质结合位点的DNA序列。检测结果目标DNA和目标蛋白质在相互作用时两者结合情况的分析（例如两者是否结合）。目标DNA和目标蛋白质在相互作用时两者结合的位置和结合位点处的DNA序列，以及蛋白质浓度对两者结合的影响。5.25比较DMS和DNasefootprinting的异同.为什么前者更精确答：DMS和DNase