分子生物学学习资料：answer-ch7

7.1描绘一幅大肠杆菌在葡萄糖和乳糖的混合物中成长的曲线图，并描述在曲线的各个阶段发生了什么。答：第一阶段，大肠杆菌利用葡萄糖作为C的来源直至葡萄糖被用尽然后它们停止生长。接着他们会在短时间内因为不能适应新的营养环境而停止生长。但是过了大概一小时后他们又开始了生长。在这一阶段，大肠杆菌会开启lac操纵子并积聚能够代谢乳糖的酶。7.2请画图说明乳糖操纵子的（1）负调控和（2）正调控。答：（1）负调控如图所示，lacI基因会表达生成一个抑制蛋白（repressor）,起作用的抑制蛋白是一个四聚体。当这个四聚体结合到DNA上（operator）时，就会阻止RNA聚合酶结合到启动子上，抑制结构基因的转录。另外DNA上也有基因片段在一定情况下能表达生成促进蛋白（induce）,它可以和抑制蛋白结合，使其发生构象的改变，以至于抑制子不能结合到DNA上，因此RNA聚合酶能顺利地结合到启动子，然后开始转录。（2）正调控CAP-cAMP复合物结合到启动子附近的一个活性位点（如图中所示的CAPbindingsite）,促进RNA聚合酶结合到启动子上，从而对基因的转录其道正调控的作用。7.3介绍β-半乳糖苷酶和半乳糖苷透性酶的功能。答：图7.3.1大肠杆菌乳糖操纵子各部分功能示意β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）一种能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。一般是指能将β-半乳糖苷水解为半乳糖和糖苷的酶。很早以来，就被认为是大肠杆菌诱导酶的典型。分子量54万，为四聚体。其结构基因为LacZ。当培养基中无诱导物质时，细胞中β-半乳糖苷酶含量很低；但一旦被诱导，则每一世代都能合成多达几千个分子的酶。另外，β-半乳糖苷酶一般广泛存在于动植物界中。图7.3.2β-半乳糖苷酶的催化反应β-半乳糖苷透性酶（galactosidepermease）lacY编码，是一种分子量为30kDd膜结合蛋白，构成转运系统，通过改变细胞膜对半乳糖的通透性，将半乳糖苷运入到细胞中。7.4为什么说lac操纵子的正、负调控在大肠杆菌的能量代谢中有重要的作用？答：在大肠杆菌细胞中，调控乳糖分解的三种酶的基因转录是由同一个启动子控制的，当外界条件改变时它们同时被启动，又同时被抑制。这使得细胞对外界的反应更加敏感。更能有效的应对外界变化。负调控使得在乳糖不存在时编码这些酶的基因被抑制子阻遏，（通过抑制子与操纵基因结合，阻止了RNA聚合酶与启动子结合）细胞不能编码产生这些没有用的酶，这使得细胞中的物质不会被浪费。而在乳糖存在的条件下，通过异乳糖作为一个诱导物改变抑制子构象使其脱离操纵基因，从而RNA聚合酶得以与DNA接合转录得以实现。这样通过外界条件的指示作用，“告诉”细胞能够被利用的能源情况，可以很大程度上减少在没有底物时却浪费细胞中的成分合成无用的酶，也能在底物存在时，让细胞有选择的使用乳糖作为能源。正调控使得单单乳糖存在这一条件还不足以让半乳糖苷酶，半乳糖转酰酶和半乳糖透过酶很好的合成，还需要外界葡萄糖浓度低到一定程度加以支持。因为细胞能够更有效的利用葡萄糖（单糖），而半乳糖的利用并不是非常划算，若在还有很多葡萄糖能供利用时细胞却因为半乳糖的存在而分解半乳糖，也是一种不经济的机制。所以细胞需要在葡萄糖含量很低的时候通过提高细胞内c-AMP的含量，并使之与分解促进蛋白结合，然后整体结合到DNA上，促进形成开放复合体，从而促进RNA的转录。当细胞中葡萄糖含量高时，会抑制c-AMP的产生，从而使这种正向的作用调解缺少了。从而分解乳糖的酶的基因转录还不能很活跃，大肠杆菌还是主要有效的利用葡萄糖作为能源，选择了一条更高效的机制，又保证了在葡萄糖消耗尽时还能通过分解乳糖维持生命。从以上观之，负调节的作用主要是防止细胞中资源的浪费，而正调节的作用主要是选择一条更有效的资源利用途径，两个机制都很好的保证了它的能源利用最合理化。7.6描述一个证明聚合酶在乳糖抑制物已与操纵子结合的情况下仍能与乳糖启动动子结合的实验，并预期结果。答：实验过程如下：（1）取三个器皿编号1、2、3，并加入等体积含有等量包括乳糖启动子的DNA片段的溶液。（2）在2、3中加入含有乳糖阻抑物的溶液，在1中加等量蒸馏水。（3）在乳糖抑制物与DNA结合后，加入RNA聚合酶，反应20分钟，使形成开放的转录复合物。（4）加肝素以阻止任何新的转录复合物的形成，并加入除CTP以外的所有反应物，培养5分钟。（5）加入用标记的CTP，在3中加入诱导物IPTG，在1、2中加入等量蒸馏水，反应10分钟以合成RNA。（6）电泳转录产物，电泳时在不同泳道中加入相应编号的器皿中的物质。实验结果预期： 1、3道中应该在转录产物位置有带，2中没有。因为在第4步中加了肝素以阻止任何新的转录复合物的形成，在3中有转录产物，所以在第3步有乳糖阻抑物存在时必形成了转录复合体，说明聚合酶在乳糖阻抑物已与操纵子结合的情况下仍能与乳糖启动动子结合。7.7简述实验和实验结果以说明乳糖抑制子阻止RNA聚合酶与启动子相结合.答：由图可以说明RNA聚合酶与启动子的结合是一个平衡过程。在实验中使用末端磷酸带标记的CTP参加转录过程，这样，产物焦磷酸的放射性含量就反映了转录的进行程度。在实验中，反应时间与放射含量正相关，但当加入肝素或者抑制子时，放射性含量很快不再增加，说明转录得到抑制，而肝素的作用是与聚合酶结合，阻止其与启动子结合。自然地可假设抑制因子正是与操纵子结合，从而与聚合酶相互作用，使其不能与启动子作用。7.8我们如何得知三个opereator对基因的完全表达是必须的？移去辅助operator中的一个或两个，对基因表达有什么影响？答：从图7.8中可看出，只有主操纵子O1,只能产生18倍的抑制，而O1和辅操纵子O2或O3可产生较高水平的抑制，而三者多存在时，抑制水平达最高，所以说三个opereator对基因的完全表达是必须的。去除两辅助操纵子对基因表达的影响也可直接从图中的出：去除两辅助操纵子之一，是抑制水平稍微降低，但若两辅助操纵子完全去除，使抑制水平降低了50倍。图7.8三个操纵子上变异的影响。分别将野生型和变异型的lacoperon片段载入λ噬菌体DNA，让这些噬菌体DNA浸染大肠杆菌细胞，插入其染色体。引入的lac片段包含operator、lacpromoter,lacZgene。E.coli细胞不含lzcZ基因，但有lacI基因。通过分析β-galactosidase的水平测定表达受抑制的水平7.9描述一个通过野生型CAP和变异型CAP（使cAMP与CAP之间的亲合力减小）来表现cAMP对β-牛乳糖合成的促进作用的实验，并给出相应的结论。答：Fig7.14野生型CAP和变异型的CAP与cAMP对β-牛乳糖合成的促进作用图Pastan和他的同事们让细菌提取液分别在野生型CAP和变异型CAP的条件下，同样地增大两者的cAMP浓度，观察各自的β-牛乳糖的合成情况。红色表示野生型CAP与cAMP对β-牛乳糖合成的促进作用，而绿色表示cAMP与CAP之间的亲合力减小的变异型CAP与cAMP对β-牛乳糖合成的促进作用。从图中可以看出变异型CAP与cAMP对β-牛乳糖合成的促进作用明显不如野生型的，这也就证明了CAP与cAMP的结合体才是乳糖操纵子的促进因子（而不单是cAMP）。7.10提出假说来说明CAP-cAMP如何激活Lac基因的转录，并说明其中聚合酶α亚基的C末端在其中的作用。答：CAP-cAMP的Activatorsite位于RNA聚合酶启动子的上游，相当于UPelement，当CAP-Camp二聚物结合到Activatorsite后，促使RNA聚合酶结合到LacYZA结构基因的启动子上。实验表明当去除а―subunit的CTD后，RNA聚合酶的转录水平和不被激活是没有很大的区别，而完整的RNA聚合酶的转录水平会提高很多。这说明а―subunit的CTD对于促进RNA聚合酶结合到启动子上有很大的作用。当培养集中的葡萄糖含量很高的情况下，cAMP的含量很低，因此即使没有抑制物的情况下，由于Lac的启动子是一个弱的启动子，其基本的转录水平很低。当葡萄糖的含量很低的情况下，cAMP的含量上升，cAMP和CAP结合形成复合物，两个这样的复合物形成二聚替他们一起结合到Activatorsite上，促进RNA聚合酶和DNA形成closedpromotercomplex。这样转录水平很高。LacZYA的启动子没有UPelement，是一个弱的启动子，由图我们知道当CAP-cAMP复合物的二聚体结合到Activatorsite后先党与UPelement和а―subunit的CTD作用，转录水平提高很多。证明二者相互作用的实验：（1）去掉α-subunit的CTD后即使有CAP-cAMP转录水平也很低；（2）Activatorsite和-35、-10box的距离很近；（3）通过DNasemapping发现CAP-cAMP复合物的作用位点和RNA聚合酶的结合位点距离很近（4）可以通过突变补偿的方法是两个都改变的CAP-cAMP复合物和α-subunit的CTD起到和未突变前相同的作用。7.11描述并给出显示CAP-cAMP结合在lac启动子区域后使其弯曲的电泳实验结果。答：图7.11验证CAP-cAMP-promoter复合体使启动子弯曲的电泳实验图用不同的限制性内切酶可以从不同的作用位点切开环状DNA，使启动子位于所切DNA不同的位置。由于DNA电泳时的迁移速度与弯曲发生的位置有关，弯曲位点越靠近中间，其迁移速度越慢。所以如果DNA真的由于CAP-cAMP和启动子的结合而弯曲，则不同酶所切出的产物会有不同的迁移速度，如图a,b。真实的实验结果如图d，可以看出CAP-cAMP的结合确实使lac启动子发生了弯曲，且从数据的分析中我们可以判断启动子的位置所在。7.12还有什么证据证明因CAP-cAMP结合到DNA上而使得DNA弯曲？答：当操纵子的激活位点在启动子上游较远的位点时，DNA就必须弯曲从而使得CAP与RNA聚合酶相互作用。证明CAP-cAMP在DNA上的结合使得DNA弯曲的证据有以下几个：1)对被不同酶切的质粒进行电泳。如图7.12.1。当DNA弯曲时，它在电泳中移动的速度就会减慢，弯曲越靠近中部移动速度越慢。如图中（a）红色部分是CAP的结合位点，1、2、3、4分别是四种酶的酶切位点，（b）是对质粒分别用四种酶切后的图示，已经有CAP结合在DNA上使其弯曲了。对（b）中四种酶切后的DNA进行电泳，则由前可知若DNA因CAP的结合而弯曲，四种DNA移动速度应不相同，移动速度大小关系为1<2=4<3，若DNA未弯曲则速度应相同。电泳后的速度关系如7.12.1中（c）所示，说明DNA确实因为CAP的结合而弯曲了。Fig7.12.1结合CAP的DNA的电泳2）X光晶体结构图。从图7.12.2的DNA与CAP的复合物的晶体结构图可以很明显地看出，由于CAP的结合而使得DNA有了一个九十四度的弯曲。这是对CAP的结合使DNA弯曲的直接证据。图7.12.2DNA与CAP的复合物的晶体结构图。Fig7.12.3CAP-cAMP与DNA复合物的X光晶体结构图3）替代弯曲的方法。若CAP-cAMP与DNA结合能引起DNA弯曲而促进启动子开放复合体的形成，则如果无CAP结合，但改变DNA体部分结构使其在何时位点上形成弯曲结构，也应该能促进启动子开放复合体的形成。实验时，将lac操纵子上的CAP结合位点改成（dA）.（dT）,而使DNA无CAP结合时自己弯曲，结果发现此结构也能促进启动子开放复合体的形成。这个实验说明，CAP-cAMP的结合可以使的DNA弯曲。7.13给出一个模型并解释为什么DNA的弯曲可以促进基因的转录。答：首先，这种结合会使CAP上的聚合酶结合位点调整成合适的状态来与聚合酶结合，从而将它吸引到启动子上(比如CAP-lac-promoter)。另一种把聚合酶引到启动子的方法是用DNA结合的方法引起DNA缠绕在聚合酶上，使上游的结合位点与酶能够接触到（比如arapeomoter）。7.14简述CAP(cataboliteactivatorprotein，代谢产物激活子蛋白)激活麦芽糖调控子(maltoseregulon)的作用模型。答：大肠杆菌麦芽糖调控子中含有多个基因和相应的启动子(promoter)序列，其中部分启动子受MalT（另一种调控蛋白）的控制，部分启动子受CAP控制，还有两个启动子(malEp和malKp)受MalT和CAP的双重控制。这里以最后一种为例说明CAP的作用模型。在DNA上，启动子malEp和malKp启动转录的方向是相反的，两者之间相隔271个碱基对（见图7.14.1）。两者间有5个MalT结合位点（红色）和3个CAP结合位点（蓝色）。图7.14.1启动子malEp和malKpMalT结合位点3、4、5实际上分别是两个各相差3个碱基对而互相重叠的MalT结合位点（见图7.14.2）。当CAP不存在时，MalT优先结合到3、4、5位点上。但这三个位点并非起始转录的最佳位置——在这三个位置上MalT没有与启动子的-10序列正确定位。当CAP结合到自己的结合位点上后，CAP与MalT的相互作用可将3、4、5位点上的MalT分别移动3个碱基对的位置而推到3’、4’、图7.14.2启动子malEp和malKp之间的MalT结合位点7.15给出问题14中所提出模型的实验证据。答：1)没有CAP结合位点的突变型（malKpΔ104）存在不同的MalT结合位点，因而转录产物比野生型少。2)对以上的突变型进一步突变会使MalT结合在其他位点进而重新获得一部分活性。3)在5~-10box之间删除三个碱基对会使得3，4，5位点完美地与启动子结合，这样就可以重获活性。4)DNase，DMS，oxygenradical三种footprinting方法可以给出更为详细的证据。7.16请解释以下现象并用图表示例：在araBAD操纵子中的araO2和araI位点之间插入整数倍DNA螺旋（即10.5bp的整数倍）的序列仍然可以由AraC抑制转录；但如果插入非整数倍DNA螺旋的序列则这种抑制作用消失。答：AraC与araO2和araI1分别结合，抑制了araPBAD。其原理如下图：双链DNA可以形成一个弯曲结构，将两个蛋白质结合位点拉在一起，结合在DNA上的蛋白质即可相互作用，使这个弯曲结构更稳定。从而达到两个相距较远的蛋白质结合位点共同作用的效果。但前提是这两个蛋白质结合位点必须在DNA双螺旋结构的同侧，因为DNA就如同钢丝，可以弯曲但无法扭曲。因此，如果在araO2和araI位点之间插入整数倍的DNA螺旋（即10.5bp的整数倍）的序列，两个AraC结合位点仍可保证在DNA螺旋的同侧；但如果插入非整数倍DNA螺旋，两个AraC结合位点将会在螺旋的不同侧，如上图右所示。此时双螺旋DNA由于无法扭曲，不能使两个AraC相互作用，也就无法达到抑制转录的效果。7.18描述一个实验证明阿拉伯糖可破坏AraC形成的抑制环（loop），并给出实验结果。答：这个实验有两个部分组成。第一部分，将阿拉伯糖加入已形成抑制环微环物（minicircle）中，同时用不加阿拉伯糖的微环物做对照，培养并进行电泳分析。第二部分，用已形成抑制环的微环物进行电泳，在电泳开始后，在一个泳道中加入阿拉伯糖，另一个不加以做对照。实验可得以下结果：第一部分，如图（a）所示，第四道为微环物加入阿拉伯糖后的图像，由图可知，加入阿拉伯糖后，抑制环消失，微环物电泳移动速率变慢；第二泳道为没有加阿拉伯糖的微环物，由图可知，抑制环存在，电泳速率较快。第二部分，如图（b）所示，第四道为电泳开始时未加阿拉伯糖，则抑制环存在；第四道为电泳开始后加入阿拉伯糖，则抑制环消失。由这个实验可以证明阿拉伯糖能破环抑制环。7.19描述一个应用araO2和araI来形成抑制环的实验并给出实验结果。答：实验是由Lobell和Schlief做的，他们先用电泳证明了在没有树胶醛糖的情况下AraC可以导致环的形成。他们用一个DNA的小型超螺旋环来代替整个大肠杆菌的DNA，这种叫作minicircle的小型超螺旋环含有araO2和araI。然后他们加入了AraO2并且利用成环的超螺旋DNA比未成环的更剧具电泳能力来测定成环情况。实验表明所成环的稳定性与AraC和araO2，araI的结合有关。7.20描述一个实验证明消除阿拉伯糖可以使被打开的抑制环重新成环，并给出实验结果。答：1）首先，Lobell和Schleif通过实验证明了AraC可以促使DNA形成抑制ara操纵子作用的环状结构以及arabinose（阿拉伯糖）可以打开这种抑制环这两点，这是进行以下实验的前提。2）接着，Lobell和Schleif利用实验证明了消除阿拉伯糖可以使被打开的抑制环重新成环，具体过程如下：a.用AraC使经过标记的DNA成环（该步骤中溶液内不含阿拉伯糖）；b.加入过量未标记的竞争DNA；c.加入阿拉伯糖，使抑制环打开；d.用含有阿拉伯糖的缓冲液去稀释DNA；e.用另一份不含阿拉伯糖的缓冲液去稀释上一步骤所得的溶液（中的阿拉伯糖）f.电泳成像3)实验结果如下图：照片上方的图表也表明了该实验的过程，电泳显示结果如下：泳道1：向标记过的DNA溶液中加入竞争性DNA而未加AraC——没有检测到环状复合体泳道2：向标记过的DNA溶液中依次加入AraC和竞争性DNA——检测到稳定的环状复合体泳道3，4：向已成环的DNA溶液中加入含有竞争性DNA和阿拉伯糖的缓冲液——复合体稳定性明显下降，环被打开泳道5，6：用不含阿拉伯糖的缓冲液稀释前一溶液中的阿拉伯糖——复合体重新成环4)结论：以上实验结果证明，消除阿拉伯糖可以使被打开的抑制环重新成环。7.21描述一个实验并写出实验结果。要求该实验能说明在开放DNA（unlooped）而不是弯曲DNA(looped)中，araI2元件对AraC调节因子的结合起重要作用。答：实验中采用只含阿拉伯糖操纵子的超螺旋环状DNA（minicircle），大约含404个碱基对。图7.21.1阿拉伯糖操纵子的弯曲与开放形态同时实验中采用araI2元件突变体与野生型的对照实验，先加入AraC使DNA弯曲(looped)，然后加入阿拉伯糖，观察各实验组能否改变至开放态，同时为了能做出更清晰的区分条带，加入限制酶Hind=3\*ROMANIII使环状DNA打开为线性，便于电泳分离。图7.21.2实验结果预计（a）AraC存在情况下，加入阿拉伯糖，野生型中的开放式DNA不断增加，说明基因形态从弯曲型（looped）向开放型（unlooped）转变；而在araI2元件突变体中则不存在这一转变现象，说明araI2元件的不正常使AraC只能与araI1及araO2元件结合，DNA始终处于弯曲状态。（b）为使上述结果更为明显，使用限制酶Hind=3\*ROMANIII，将环状的DNA切成直线型，是电泳结果更为明显，在野生型中出现了开放DNA的条带，而araI2元件突变体中不存在。通过上述实验，我们就可以发现，araI2元件与AraC的结合，是产生于开放形态（unlooped）DNA，而不是弯曲形态（looped）。7.22提出一个模型并解释trp操纵子的负调