生物化学课件：5酶

酶的概念酶的分类与命名酶的化学本质酶的结构与功能的关系酶作用的专一性酶作用的机理酶促反应的速度和影响酶促反应速度的因素酶的制备与酶活力的测定酶的应用第五章酶酶的发现★酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的高分子生物催化剂。

★1957巴斯德提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。

1分子Glc→2分子乙醇+2分子CO2

从Glc开始，经过12种酶催化，12步反应，生成乙醇。

★1897Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动无关，不含细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。

★1913Michaelis和Menten提出米氏学说—酶促动力学原理。

★1926Sumner首次从刀豆中提出脲酶结晶，并证明具有蛋白质性质。

★1969化学合成核糖核酸酶。

★1967-1970从E.coli中发现第I、第II类限制性核酸内切酶。

★1986Cech发现四膜虫细胞大核期间26SrRNA前体具有自我剪接功能。酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。酶：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。一、酶的概念2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；酶具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；3.通过降低活化能加快化学反应速度。酶的催化特点（5）、酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子（1）、催化效率高

酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且至少高出非酶催化反应速度几个数量级。

（2）、专一性高酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。（3）、反应条件温和

温度低于100℃，正常大气压，中性pH环境。（4）、活性可调节

根据据生物体的需要，许多酶的活性可受多种调节机制的灵活调节，包括：别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。

二、酶的分类与命名1961年6以前使用的酶沿用习惯命名

◆1.（绝大多数酶）依据底物来命名

如：催化蛋白质水解的酶称蛋白酶。催化淀粉水解的酶称淀粉酶。

◆2.依据催化反应的性质命名

如：水解酶、转氨酶

◆3结合上述两个原则命名，琥珀酸脱氢酶。

◆4.有时加上酶的来源

如：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶

习惯命名较简单，但缺乏系统性。（一）习惯命名（二）国际系统命名与分类法反应：丙氨酸+α--酮戊二酸→Glu+丙酮酸系统名称应明确标明酶的底物及催化反应的性质。每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“·”隔开。第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。1.命名如：草酸氧化酶（习惯名），系统名：草酸：氧氧化酶

又如：谷丙转氨酶（习惯名）,系统名：丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶2.分类将所有酶促反应按性质分为六类，分别用1、2、3、4、5、6表示。原则：再根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3……，每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3……表示。（三）酶的分类

1、氧化还原酶类Oxidoreductase催化氧化还原反应：AH2+B=A+BH22、转移酶类Transferase

AB+C=A+BC，如谷丙转氨酶，胆碱转乙酰酶等。氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。

例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。4、裂合酶类（裂解酶）Lyase催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应

二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7），习惯名：醛缩酶

3、水解酶类hydrolase

催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。

亮氨酸氨基肽水解酶，习惯名：Ile氨肽酶。水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。5、异构酶（EC5.3.1.9）Isomerase

催化同分异构体相互转化，6-磷酸Glc异构酶催化一切必须与ATP分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。

6、合成酶（连接酶）LigaseorSynthetase

异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。

例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H===A

B+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2

草酰乙酸图表table8-3EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号酶表示例★这个跟类方法的一大优点就是一切新发现的酶都能按照这个系统得到适当的编号。★酶表是表示酶的一种方法，在酶表中每一种酶的位置都可以用一个统一的编号表示。这种编号包括4种数字，用EC代表酶学委员会，以乳酸脱氢酶（EC1.1.1.27）为例。三、酶的化学本质1.酶的蛋白质本质2.酶的辅因子3.单体酶、寡聚酶和多酶复合物有些酶仅由蛋白质组成，例如，脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等；有些酶不仅含有蛋白质（酶蛋白），还含有非蛋白质成分（辅助因子），只有酶蛋白与辅助因子结合形成复合物（全酶）才表现出酶活性，如超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）。酶的专一性由酶蛋白的结构决定，辅助因子传递电子或某些化学基团。

1.酶的蛋白质本质ribozyme核酶1980以前，已知所有的生物催化剂，其化学本质都是蛋白质。

80年代初，美国科罗拉多大学博尔德分校的ThomasCech和美国耶鲁大学SidneyAltman各自独立发现RNA具有生物催化功能，此发现被认为是近十年生化领域最令人鼓舞的发现，此二人分亨1989诺贝尔化学奖。

ribozyme种类：①自我剪接ribozyme②自我剪切ribozyme③催化分子间反应ribozyme

所有的酶都是蛋白质，酶是具有催化功能的蛋白质，因此酶具有蛋白质的一切共性。酶的蛋白质组成经典概念：图表table8-1※辅酶：与酶蛋白结合较松，可透析除去。

※辅基：与酶蛋白结合较紧

2.酶的辅因子※按照化学本质可以把酶分成两大类：单纯酶和结合酶。※结合酶除了含有蛋白质外，还含对热稳定的非蛋白小分子物质，前者称为酶蛋白，后者称为辅因子。两者单独存在时均无催化活力，只有两者结合成完整的分子知，才具有活力。这种分子被称为全酶。※酶的辅助因子主要有金属离子（Fe2+、Fe3+、Cu+、Cu2+、Mn2+、

Mn3+、Zn2+、Mg2+、K+、Na+、Mo6+、Co2+等）和一些小分子有机化合物。这些有机化合物又称为辅酶或辅基。某些小分子有机化合物与酶蛋白结合在一起并协同实施催化作用，这类分子被称为辅酶（或辅基）。辅酶是一类具有特殊化学结构和功能的化合物。参与的酶促反应主要为氧化-还原反应或基团转移反应。大多数辅酶的前体主要是水溶性B族维生素。许多维生素的生理功能与辅酶的作用密切相关。水溶性维生素与辅酶

根据金属离子与酶蛋白结合程度，可分为两类：金属酶和金属激酶。

在金属酶中,酶蛋白与金属离子结合紧密。如Fe2+/Fe3+、Cu+/Cu3

、Zn2+、Mn2+、Co2

等。

金属酶中的金属离子作为酶的辅助因子，在酶促反应中传递电子，原子或功能团。酶分子中的金属离子金属酶中的金属离子与配体金属离子配体酶或蛋白Mn2

咪唑丙酮酸脱氢酶Fe2+/Fe3+

卟啉环，咪唑，血红素，含硫配体氧化-还原酶过氧化氢酶Cu+/Cu2+

咪唑，酰胺细胞色素氧化酶Co2+

卟啉环变位酶Zn2+-NH3，咪唑，（-RS）2

碳酸酐酶，醇脱氢酶Pb2

-SHd-氨基-g-酮戊二酸脱水酶Ni2

-SH尿酶金属激酶中的金属离子

激酶是一种磷酸化酶类，在ATP存在下催化葡萄糖，甘油等磷酸化。

其中的金属离子与酶的结合一般较松散。在溶液中，酶与这类离子结合而被激活。

如Na+、K+、Mg2+、Ca2+

等。金属离子对酶有一定的选择性,某种金属只对某一种或几种酶有激活作用。1.单体酶（monomericenzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。2.寡聚酶(oligomericenzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。3.多酶复合物(multienzymesystem)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。3.单体酶、寡聚酶和多酶复合物四、酶的结构与功能的关系酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。酶的结合部位Bindingsite催化部位catalyticsite酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。调控部位Regulatorysite酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。必需基团活性部位维持酶的空间结构结合基团催化基团专一性催化性质（一）活性部位和必需基团酶活性中心的必需基团主要包括：亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。示意图（二）酶原的激活★没有活性的酶的前体称为酶原。酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活。这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。★在组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏。（三）同工酶(isoenzyme)同工酶：能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。乳酸脱氢酶（LDH）MHMMMMM4MMMHM3HHMMHM2H2MHHHMH3HHHHH4酶作用的专一性结构专一性立体异构专一性族（基团）专一性绝对专一性五、酶作用的专一性酶作用专一性的机制酶分子活性中心部位，一般都含有多个具有催化活性的手性中心，这些手性中心对底物分子构型取向起着诱导和定向的作用，使反应可以按单一方向进行。酶能够区分对称分子中等价的潜手性基团。族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。RCOO-+ROH+H+′酯酶：R—C—O—R′+H2OOα-葡萄糖苷酶:+H2O+ROH绝对专一性：只能作用于某一底物。脲酶：H2N—C—NH2+H2OO2NH3+CO2酶作用的专一性OROOHOHCH2OH15OHOOHOHCH2OH15OHOH六、酶的作用机理（一）酶的催化作用与分子活化能化学反应自由能方程式ΔG=ΔH-TΔS（ΔG是总自由能的变化，ΔH

是总热能的变化，ΔS是熵的变化）当ΔG＞0，反应不能自发进行。当ΔG＜0，反应能自发进行。★活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol反应物全部进入活化状态所需的自由能。示意图（二）中间产物学说E+SESE+P★中间产物存在的证据：1.同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶－底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。示意图活化能降低酶促反应：E+S===ES===ES

EP

E+P反应方向,即化学平衡方向,主要取决于反应自由能变化

H

。而反应速度快慢,则主要取决于反应的活化能Ea。催化剂的作用是降低反应活化能Ea,从而起到提高反应速度的作用

反应过程中能的变化酶催化作用的本质是酶的活性中心与底物分子通过短程非共价力(如氢键,离子键和疏水键等)的作用，形成E-S反应中间物，其结果使底物的价键状态发生形变或极化，起到激活底物分子和降低过渡态活化能作用。

（三）诱导嵌合学说“锁钥学说”（Fischer，1890）：酶的活性中心结构与底物的结构互相吻合，紧密结合成中间络合物。“三点结合”的催化理论认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。诱导嵌合学说（Koshland，1958）：酶活性中心的结构有一定的灵活性，当底物（激活剂或抑制剂）与酶分子结合时，酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置，这样才能使酶与底物完全吻合，结合成中间产物。诱导契合学说示意图酶与底物的过渡态互补，亲合力最强，释放出结合能使ES的过渡态能级降低，有利于底物分子跨越能垒，加速酶促反应速度。（四）酶与反应的过渡态互补按SN2历程进行的反应，反应速度与形成的过渡状态稳定性密切相关。在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物的实际上是底物形成的过渡状态，所以，酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的亲和力。（五）抗体酶（abzyme）抗体酶：即是抗体又具有催化功能的蛋白质，是具有催化活性的抗体，又称“催化性抗体”。抗体酶的成功制备，不仅有力的证明了过渡态理论的正确，加深了人们对酶作用原理的理解，进一步丰富了酶学内容，而且创造出的新酶类在临床医学及制药工业等方面有极好的应用前景。（六）使酶具有高催化效率的因素★酶分子为酶的催化提供各种功能基团和形成特定的活性中心，酶与底物结合成中间产物，使分子间的催化反应转变为分子内的催化反应。★以下这些因素都可使酶具有高催化效率，但是，它们并不是在所有的酶中同时都一样的起作用，更可能的情况是对不同的酶起主要的因素不完全相同。

1邻近定向效应★是指底物与酶的活性部位的邻近,对于双分子反应来说也包含酶活性部位上底物分子之间的邻近,而互相靠近的底物分子之间以及底物分子与酶活性部位的基因之间还要有严格的定位（正确的立体化学排列）。这样可以大大提高活性部位上底物的有效浓度，使分子见反应分子内反应，同时还为分子轨道交叉提供有利条件，使底物进入过度态时的熵变负值减小，反应活化能降低，从而大大提高了酶-底物中间产物进入过度态的几率。★

2“张力”与“形变”◆酶与底物的结合，不仅酶分子发生构象变化，同样底物分子也会发生扭曲变形，使底物分子的某些键的键能减弱，产生键扭曲，降低了反应活化能。这是一个形成内酯的反应。当R＝CH3时，其反应速度比R＝H的情况快315倍。由于-CH3体积比较大，与反应基团之间产生一种立体排斥张力，从而使反应基团之间更容易形成稳定的五元环过渡状态。★通过向反应物（作为碱）提供质子或从反应物（作为酸）夺取质子来达到加速反应的一类催化。（广义酸碱催化，Bronsted的酸碱定义）★蛋白质中起酸或碱催化的功能基团有氨基、羧基、咪唑基、巯基和酚基。★影响酸碱催化反应速度的两种因素：（1）酸或碱的强度（pK）；（2）质子传递的速度。His的咪唑基最活跃。

3酸碱催化酶分子中可以作为广义酸、碱的基团His是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。广义酸基团广义碱基团（质子供体）（质子受体）★底物分子的一部分与酶分子上的活性基团间通过共价结合而形成的中间物，快速完成反应。★Lewis的酸碱电子理论：酸是可以接受电子对的物质，而碱则是可以提供电子对的物质，前者是亲电物质，后者是亲核物质。共价催化又称亲核或亲电子催化。实际上也是酸碱催化。Ser-OH—CH2—S··：H—CH2—O··：HCys-SHN—CH2—C=CHHNCH：His-咪唑基亲核物质亲电物质

4共价催化

5金属离子催化金属离子可以和水分子的OH-结合，使水显示出更大的亲核催化性能。

提高水的亲核性能

电荷屏蔽作用※电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能。※多种激酶(如磷酸转移酶)的底物是Mg2+－ATP复合物。

电子传递中间体许多氧化-还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。

酶的活动中心由于微环境的影响，存在高浓度的酸和高浓度的碱，可以有多种催化方式的环境有利于反应的进行。

6微环境的影响酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括低物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。七、酶促反应的速度和影响酶促反应速度的因素（一）酶反应速度的测量方法：（1）测量单位时间内底物的消耗量（2）测量单位时间内产物的生成量注：因反应体系中底物大量存在，测定难于准确，故一般采用方法（2）。(二)酶浓度对酶促反应速度的影响因为V=k3[E]Vm=k3[E0]所以V与E成正比因为Vm不仅受[E]的影响,也受[S]的影响,故对于保证上述线性关系必须有两个先决条件:(1)一定是初速度,这也是测定反应速度的基本要求(2)[S]一定要高,高到多少?([S]>100Km)1902年，V.Henri在研究蔗糖酶水解蔗糖的反应中，发现随着底物浓度的增加，反应速度上升呈双曲线型，即在底物浓度低时v呈直线上升，而在[S]高时,v上升很少，当[S]大到某一浓度时,v达到一个极限值。Henri根据这个实验结果，提出了“酶－底物中间复合物（体）”学说，他认为，在底物转化为产物前，必须先与酶形成中间复合体，后者再转变成产物而重新释放出游离的酶。即

k1

k3

E＋S↔ES→E+P

k2

（三）底物浓度对酶作用的影响（三）底物浓度对酶作用的影响单底物酶促反应，包括异构酶、水解酶及大部分裂合催化的反应。

1913Michaelis

和Menten

提出米氏方程。

1．底物浓度对酶作用的影响我们可以用中间产物学说解释底物浓度与反应速度关系曲线的二相现象：当底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底物浓度的增加，中间络合物的浓度不断增高。当底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间产物，虽增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成。k1k2k3S+EESE+P

2.1米式方程的导出(1)1、基于快速平衡假说——早年的米式方程

最初，Michaelis和Menten是根据“快速平衡假说”推出米式方程★快速平衡假说：

1913年，Michaelis和Menten根据他们提出的学说，对双曲线进行了数学处理，其推导过程是基于以下三点假说：1.测定的v为反应初速度。此时[S]消耗很小，故在测定反应速度所需的时间内，产物P的生成极少，那么由P+E----ES的可能性可不予考虑。2.[S]>>[E]即[ES]的形成不会明显的降低[S],[S]以起始[S]计算。3.[ES]形成的速度显著快于[ES]形成P+E的速度，即E+S---ES的可逆反应在初速度测定的时间内已达到平衡，ES分解生成产物的速度不足以破坏这个平衡，这就是快速平衡学说（rapidequilibrium)设：[ES]形成E+S的解离常数为Ks,则Ks=k2/K1=[E][S]/[ES]…………………..(1)若酶的原始浓度为[E0],达到平衡时E的浓度＝[E0]-[ES]依据上述假设2，[S]保持不变，故（1）式可改写为Ks[ES]=[E][S]=([E0]-[ES])[S]Ks[ES]+[ES][S]=[E0][S]………………….(2)因为反应速度v取决于[ES],即v=k3[ES][ES]=v/k3……..(3)当[S]为极大时，全部[E]均转变为[ES],[ES]=[E0]此时v=Vmax

所以Vmax

＝k3[E0][E0]=Vmax/k3…..(4)将（3）（4）代入（2）得v(ks+[S])/k3=Vmax[S]/k3,整理得V=Vmax[S]/(Ks+[S])….(5)式（5）即为米氏方程（Michaelis-Mentemequation)式中v：初速度，Vmax：最大反应速度，ks=k2/k-2为[ES]的解离常数。它反应了反应初速度与底物浓度的关系，如果作v-[S]图则为一条矩形双曲线，由此可见，此方程式与实验结果是相符的。以v=1/2Vmax代人（5），得ks=[S],ks就是v=1/2Vmax时的[S]Ks的倒数1/ks=k1/k2为亲和常数，可代表E和S形成中间复合物ES的亲和力，ks越小，[ES]不易解离，E与S亲和力大，反之，ks很大，则E与S亲和力小米式方程的导出(2)2、Briggs和Haldane的“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：★稳态平衡假说：

这个学说认为，在测定初速度的过程中，[S]降低，[P]上升，而中间复合物[ES]在一开始增高后，可在相当一段时间内保持浓度的恒定，在这段时间内，ES生成的速度和ES消逝的速度相等，达到动态平衡，这就是所说的稳态，在进行公式推导时，保留了MichaelisandMenten的前两点，而将第三点“平衡”假设修改为“稳态”假设。根据式（1）[ES]的生成速度：d[ES]/dt=k1[E][S][ES]的分解速度：－d[ES]/dt=k2[ES]+k3[ES]当处于稳态时ES的生成速度和分解速度相当，故K1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]=(k2+k3)[ES],同样[E]=[E0]-[ES],则k1([E0]-[ES])[S]=(k2+k3)[ES][E0][S]-[ES][S]=(k2+k3)[ES]/K1令：(k2+k3)/k1=km即米氏常数（Michaelisconstant)故[E0][S]-[ES][S]=Km[ES][E0][S]=[ES](Km+[S])……………..(2)同理[E0]=Vm/k3[ES]=V/k3代入（2）得Vm[S]/k3=V(Km＋[S])/k3V=Vm[S]/(Km+[S])……(3)比较发现，两式完全一样，区别仅在于Km取代了Ks。为了纪念Michaelis和Menten

的开创性工作，习惯上把以上两式叫做米氏方程。

2.2

米式方程式米氏方式程中（Michaelis-Mentenequation）设km=———k3+k3k1v=——————Vmax·[S]km+[S]（km＞＞[S]，v=k[S]；km

＜＜[S]，v=Vmax）km即为米氏常数，Vmax

为最大反应速度◆当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=[S]◆上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。◆因此,米氏常数的单位为mol/L。

2.3米式方程讨论(1)2、Km的物理意义

当反应速度v=1/2Vmax时，Km=[S]；

Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度的一半时底物的浓度。

单位：与底物浓度的单位一致，mol/L或mmol/L

Km是酶的特征常数之一，一般只与酶的性质有关，与酶的浓度无关，不同的酶Km值不同。P109表5-3表示了某些酶的Km值。1、快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别

当K1、k3＞＞K3时，即ES-P是整个反应平衡中极慢的一步，那么这就是早年提出的米式方程。因此说，稳态平衡=快速平衡+慢速平衡，当ES-P（即K3/K1）极慢时，稳态平衡基本等于快速平衡。

S-V曲线图23、Km与天然底物

如果一个酶有几种底物，则每一种底物各有一个特定的Km，其中Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V变化越灵敏底物。

米式方程讨论(2)米式方程讨论(3)Km称米式常数，Km=（k3+K3）/K1

，从某种意义上讲，Km是ES分解速度（k3+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（k3/K1）和产物形成趋势（K3/K1）。

Ks称为底物常数，Ks=k3/K1，它是ES的解离常数，只反映ES解离趋势，因此，1/Ks可以表示酶与底物的亲和力大小（ES形成趋势），不难看出，底物亲和力大不一定反应速度大（产物形成趋势，K3/K1）

只有当k3、K1＞＞K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。4、Km、Ks与底物亲和力

（√）问题：（1）Km越小，底物亲和力越大（√

）（2）Ks越小，底物亲和力越大（√）（3）天然底物就是亲和力最大的底物（X）（4）天然底物就是Km值最小的底物5、Km与米式方程的实际用途

已知V求[S]；已知[S]求V。

当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，v与[S]无关，只和[Et]成正比。当v=1/2Vmax时，表示活性部位有一半被占据。米式方程讨论(4)90%V=100%V[S]/(km+[S])v=——————Vmax·[S]km+[S]即[S]=9km在进行酶活力测定时，通常用4km的底物浓度即可。从米氏方程中求得：当反应速度达到最大反应速度的90%，则

S-V曲线图3米式方程讨论(5)6、km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛乳酸脱氢酶（1.7×10-5）丙酮酸脱氢酶（1.3×10-3）丙酮酸脱羧酶（1.0×10-3）当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于km最小的酶。Km越小，表明酶与底物亲和力越大。在较低的[S]时，则可使反应速度达到相对较高。通过Km的测定，可鉴定酶的各种底物，一般认为Km的最小者为酶的最佳底物，这个最佳底物又叫作天然底物。如果已知Km，可调整实验条件，使[S]>>Km,得到最大反应速度Vmax，知道了最大反应速度，就可求出参加反应的总酶浓度，因为最大反应速度＝k3[E0].了解了Km可大致认识细胞内底物的浓度，可以推测该酶在细胞内是否受到底物浓度的调节。例：已知细胞内某种酶的底物浓度为100umol/L,此酶的Km＝0.12，问：细胞内此中酶的活力和其底物的关系。解；根据米氏方程，这里[S]=100Km=0.12[S]/Km=833.3,即[S]>>Km,则V=Vmax=k3[E0],此时为零级反应。即反应速度不受浓度的影响，故酶活力不受底物浓度调节。分析：若[S]<<Km,结果会如何？结果：V=Vm[S]/Km为一级反应，表明细胞内的酶活力受[S]影响很大，即酶活力对[S]的变化敏感，在代谢途径中，此酶是限速酶。若；[S]在Km左右，则V与[S]呈双曲线关系，表明细胞内的某种酶活力对[S]不太敏感，此酶是非限速酶。另外，比较不同来源的酶对同一底物的Km，也可使我们知道他们是否有差别。以上讨论了Km关于k3

k3表示每个酶分子在单位时间内使底物转变为产物的分数。k3＝Vmax/[E0]他反映酶催化中间复合物转变为产物的能力或效率，

k3越大，表示酶的催化效率越高，对特定条件下的酶反应,k3是特征性常数，Vmax＝k3[E0]，反映在该酶浓度条件下，反应系统可能达到的最大速度。总结1.Km可被用于鉴定酶。2.比较不同来源的酶对同一底物的Km，可得出不同来源的酶是否相同。3.一般说来Km最小的为其最适底物。4.测定不同抑制剂类型对Km的影响，可鉴定抑制类型。5.利用已知的Km和细胞内的[S]，根据米氏方程可得出V/Vmax的百分率，反之也可算出[S],如[S]=6Km,可得出V＝86％Vmax，[S]=100Km,V=99%Vmax6.利用已知的Km和细胞内的[S]可推断某种酶在细胞内是否受到[S]的调节。Km的求法1米氏方程可转换成各种形式,用相应的作图法求得.(1)Lineweaver-Burk法(双倒数作图法)将米氏方程转化为倒数形式1/V=Km/Vm*1/[S]+1/Vm用1/V对1/[S]作图此法是最常用的方法之一,但是误差较大,因为,数据点的分布大多集中在坐标的左下方,1/[S]的点往往偏离直线,从而影响Km和Vm的精确度.Km的求法2(2)Langmuir作图法将米氏方程改写为[S]/V=Km/Vm+[S]/Vm,以[S]/V对[S]作图,得一直线,其纵轴截矩为Km/Vm,横轴截矩为-Km,斜率为1/Vm此法近年来受到推崇,优点是数据点在图中分布均匀.双倒数作图法斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmax（四）pH对酶作用的影响稳定性pH：在一定pH范围内，酶不会变性失活，此范围称酶的稳定性pH。1.pH影响酶活力的因素

①影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。

②影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。

③影响酶和底物分子中另一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。2．酶的最适pH和稳定性pH

最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。酶在试管反应中的最适pH与它所在细胞中的生理pH不一定完全相同，为什么？酶的最适pH不是固定的常数，其数值受酶的纯度底物的种类和浓度缓冲液的种类和浓度等的影响。因此酶的最适pH只在一定条件下才有意义。示意图（五）温度对酶作用的影响2．酶的稳定性温度

在某一时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的稳定性温度。

酶的稳定性温度有一定的时间限制。

稳定性温度范围的确定方法：将酶分别在不同温度下预保温一定时间，然后回到较低温度（即酶的热变性失活作用可忽略的温度），测酶活性。

酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性温度增高。

酶的保存：①液体酶制剂可以利用上述5种因素中的几种，低温（几个月）

②干粉，可在室温下放置一段时间，长期保存，应在低温冰箱中1．最适温度及影响因素

温度对酶促反应速度的影响有两个方面：①提高温度，加快反应速度。

②提高温度，酶变性失活。

这两种因素共同作用，在小于最适温度时，前一种因素为主；在大于最适温度时，后一种因素为主。最适温度就是这两种因素综合作用的结果。

温度系数Q10：温度升高10℃，反应速度与原来的反应速度之比，Q10一般为1~2。

温血动物的酶，最适温度35℃—40℃，植物酶最适温度40℃—50℃，细菌TaqDNA聚合酶70℃。Tv最适温度

T-V曲线图双底物酶促反应动力学1

为了便于对这类动力学进行讨论,通常按反应方式和历程分为俩大类,即顺序机制和乒乓机制,顺序机制又叫序列机制,其主要特征是:底物的结合与产物的释放有一定的顺序,根据酶和底物是否存在一定的前后顺序,有将它分为两类,即有序顺序反应和随机顺序反应.1.序列有序机制(compulsoryordermechanism)

有序机制是指:底物A和B和酶的结合有严格的顺序,一定是先A后B,产物释放也是先P后QE+AEA+BEABEPQEQE+QPA叫做领先底物,B叫做随后底物,P叫第一产物,Q叫第二产物许多以NAD+及NADP+为辅酶的脱氢酶类即属于此类酶.双底物酶促反应动力学2NAD+苹果酸NADH+草酰乙酸2.随机顺序机制少数脱氢酶和激酶属于此类反应机制乒乓机制(ping-pongmechanism)其特征为E与A结合生成复合体,产物P的脱离在另一底物B的加入之前,S与P交替地与E结合或从E释放,故称为乒乓机制.属于此类的酶大多数是具有辅酶的,如转氨酶等.乒乓机制的速度方程为（六）激活剂对酶作用的影响2、简单有机分子的激活作用

①还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。

②金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑制作用。凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂（activator）

激活剂作用包括两种情况：

一种是由于激活剂的存在，使一些本来有活性的酶活性进一步提高，这一类激活剂主要是离子或简单有机化合物。

另一种是激活酶原，无活性→有活性，这一类激活剂可能是离子或蛋白质1、无机离子的激活作用

（1）金属离子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+

（2）阴离子：cl-、Br-

（3）氢离子

许多金属离子是酶的辅助因子，是酶的组成成分，参与催化反应中的电子传递。

有些金属离子可与酶分子肽链上侧链基团结合，稳定酶分子的活性构象。

有的金属离子通过生成螯合物，在酶与底物结合中起桥梁作用。注意：

（1）无机离子的激活作用具有选择性，不同的离子激活不同的酶。

（2）不同离子之间有拮抗作用，如Na+与K+、Mg+与Ca+，但Mg+与Zn+常可替代。

（3）激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1~50mM（七）抑制剂对酶作用的影响※酶是protein，凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为酶的失活作用。

※抑制作用：使酶活力下降但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用。（不可逆抑制、可逆抑制）

※抑制剂（inhibitor）：不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上某些必需基团（活性中心上一些基团）发生变化，引起酶活性下降，甚至丧失，此类物质称为酶的抑制剂。

※研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：

（1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发：抗癌药

（2）对生物体的代谢途径进行认为调控，代谢控制发酵

（3）研究酶的活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计农药，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。[E]v1231.反应体系中不加I2.反应体系中加入一定量的不可逆抑制剂3.反应体系中加入一定量的可逆抑制剂[E]v不可逆抑制剂的作用[I]→[E]v可逆抑制剂的作用[I]

1.不可逆抑制作用抑制剂与酶的结合是一不可逆反应。抑制剂与酶活性中心基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透析法除去抑制剂而恢复酶活力，这种抑制剂称为不可逆抑制作用。不可逆抑制剂可分为非专一性和专一性不可逆抑制剂。（1）、非专一性不可逆抑制剂

此类抑制剂可以和一类或几类基团反应。它们不但能和酶分子中的必需基团作用，同时也能和相应的非必需基团作用。①酰化剂

二异丙基磷酰氟酯（DFP，神经毒气）和许多有机磷农药都属于磷酰化剂，能与酶活性中心Ser的—OH结合，抑制某些蛋白酶及酯酶。这类化合物的作用机理是强烈地抑制与中枢神经系统有关的乙酰胆碱脂酶，使乙酰胆碱不能分解为乙酰和胆碱。乙酰胆碱的堆积，引起一系列神经中毒症状。解毒剂：PAM（解磷定），可以把酶上的磷酸根除去。③氰化物：与含铁扑啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸。

④重金属：Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除⑤还原剂

以二硫键为必需基团的酶，可以被巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原失活。

⑥含活泼双键试剂（与-SH、-NH２反应）：N-乙基顺丁烯二酰亚胺②、烷化剂

许多有机汞、有机砷都是烷化剂，可以使酶的巯基烷化，有机汞、有机砷化合物和重金属还可以与还原型硫辛酸（人体重要的辅酶）反应

解毒剂：二巯基丙醇

⑦亲电试剂:四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。（2）、专一性不可逆抑制

此类抑制剂仅仅和活性部位的有关基团反应。

①Ks型专一性不可逆抑制剂

Ks型抑制剂不仅具有与底物相似的、可与酶结合的基团，同时还有一个能与酶的其它基团反应的活泼基团。②Kcat型专一性不可逆抑制剂

这种抑制剂是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，既能与酶结合，也能被催化发生反应，在其分子中具有潜伏反应基团（latentreactivegroup），该基团会被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团进行不可逆结合，使酶受抑制。此种抑制专一性强，又是经酶催化后引起，被称为自杀性底物。

举例：β-羟基癸酰硫酯脱水酶的Kcat型不可逆抑制剂：CH3(CH2)5-C=C-CH2-CO-S-R举例：胰凝乳蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂：对一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）与该酶的最佳底物对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的结构相似，都含有对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰基，酶通过对这个基团的强亲和力，把TPCK误认为底物而与之结合，形成Ks很小的非共价络合物。

最佳底物TPCK-CH2-cl与酶活性部位的一个His-咪唑基距离很近，很易使之烷基化，而非活性部位的咪唑基，由于远离-CH2-cl，则不被烷基化。专一性：抑制剂与酶活性部位某基团形成的非共价络合物和抑制剂与非活性部位同类基团形成的非共价络合物之间的解离常数不同。可逆抑制作用的分类1.竞争性抑制作用2.反竞争性抑制作用3.非竞争性抑制作用4.混合型抑制作用

2.1可逆抑制作用

此类抑制剂与酶蛋白的结合是可逆的，可以用透折法除去抑制剂，恢复酶的活性，这种抑制作用称为可逆的抑制作用。（1）竞争性抑制（Competitiveinhibition）

抑制剂与底物竞争酶的活性中心，竞争性抑制剂具有与底物类似的结构，可与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。竞争性抑制作用：抑制剂和底物竞争与酶结合。v=———————V[S]km(1+[I]/ki)+[S][S]vV/2km2）抑制程度取决于I和S的浓度以及与酶结合的亲和力大小。km′无I有I3）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似。特点：1）抑制剂和底物竞争酶的结合部位ki=[E][I]/[EI]见示意图1示意图1磺胺类药物的药理（对氨基苯磺酰胺）：

嘌呤核苷酸的合成必需要由四氢叶酸（辅酶）提供一碳单位；四氢叶酸可由二氢叶酸或叶酸转化而成；二氢叶酸是在二氢叶酸合成酶作用下，利用蝶呤、对氨基苯甲酸及Glu合成。

动物体内的叶酸可从食物中获取，细菌体内的叶酸只能在二氢叶酸合成酶作用下，利用对氨基苯甲酸合成。

如果动物体内含有大量的对氨基苯磺酰胺，可与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶的活性中心，抑制细菌二氢叶酸合成。举例：磺胺类药物及其作用机理磺胺类药物可以抑制细菌的生长繁殖，治疗细菌引起的各种疾病，磺胺类药物是对氨基苯磺酰胺或其衍生物，它是对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制二氢叶酸合成酶示意图2示意图3

非竞争性抑制剂多是与酶活性中心之外的巯基可逆结合，包括某些含金属离子的化合物（Cu2+、Hg2+、Ag+）和EDTA。（2）、非竞争性抑制特点：抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，其结构可能与底物无关。酶可以同时与底物及抑制剂结合，但是，中间产物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。显然，不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。v=———————————V1+[I]/ki·[S]km+[S][S]v无Iv/2km有I(′)酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+S→ES+I≠P（3）、反竞争性抑制反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。v=———————V1+——[I]ki·[S]km1+——[I]ki+[S][S]vkm′km

2.2可逆抑制作用的动力学(1)、竞争性抑制：

（1）Vmax不变，Km变大。要达到同一个给定的Vmax分数，必须要有比无抑制剂时大得多的底物浓度。

（2）竞争性抑制剂对酶促反应的抑制程度，决定于[I]、[S]、Km和Ki

A.[I]一定，增加[S]，可减少抑制程度。

B.[S]一定，增加[I]，可增加抑制程度（Km’增加）。

C.Ki值较低时，任何给定[I]和[S]，抑制程度都较大，Ki越大，抑制作用越小D.[I]=Ki时，所作双倒数图直线的斜率加倍。

E.在一定[S]、[I]下，Km值愈低，抑制程度愈小。

非竞争性抑制剂可使酶促反应的Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki），而对Km无影响。它对酶促反应的抑制程度决定于[I]和Ki

，与酶的Km和[S]无关。

(2)、非竞争性抑制

在反竞争性抑制作用下，Km及Vmax都变小，且Km’<Km

(3)、反竞争性抑制（4）混合型抑制作用1.含义：S和I对E的结合互不排斥，但是Ks不等于K’s2.反应式：当Ki<K’i时兼有部分竞争性抑制作用,属于非竞争性抑制与竞争性抑制之间的类型.当Ki>K’i时兼有部分反竞争性抑制作用,属于非竞争性抑制与反竞争性抑制之间的类型混合型抑制作用3.动力学特征讨论(1)有I时,Vm随I增大而减小,当Ki>K’i时,Km随I增大而减小.当Ki<K’i时,Km随I增大而增大.(2)随I增加而增加.当Ki>K’i时,随[S]增大而增大(反竞争占优),当Ki<K’i时,随S增大而减小(竞争占优)相互关系3.与上述三种抑制的关系(1)当K’i趋近于无穷大时,只有EI复合物,无ESI,属于竞争性抑制(2)当Ki趋近于无穷大时,只有ESI,无ES,属于反竞争性抑制.(3)当Ki=K’i时,EESI和EIIS结合力相等,即亲和力相等,属于非竞争性抑制.(4)当Ki不等于K’I时,属于混合性抑制.

3.抑制作用的机制⑴.抑制剂与酶结合成极稳定的络合物，从而减低或破坏酶的活性。⑵.破坏酶或辅基的活性基团或改变活性位的构象。（如重金属（Ag+、Hg2+）和类金属（As3+）破坏SH）⑶.夺取酶与底物结合的机会，从而减少酶的作用。（竞争性抑制剂）（反馈抑制）⑷.阻抑反应的顺利进行S+EESE+P4.酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。（八）酶的别构效应①已知的别构酶都是寡聚酶，含有两个或两个以上亚基

②具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心负责底物结合和催化，别构中心负责调节酶反应速度。活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。

③多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同种效应，底物就是调节物：有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。

④别构酶由于同位效应和别构效应，不遵循米式方程，动力学曲线也不是典型的双曲线型，而是S型（同位效应为正协同效应）和压低的近双曲线（同位效应为负协同效应）。

别构效应：调节物（效应物）与别构酶分子中的别构中心（调节中心）结合后，诱导产生或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合催化作用受到影响，从而调节酶促反应的速度。（1）、别构酶的结构特点和性质

别构效应示意图②同位效应为负协同效应的别构酶是近似双曲线

负协同效应时酶的反应速度对底物浓度的变化不敏感（2）、别构酶的动力学曲线P117图5-19①同位效应为正协同效应的别构酶是S型曲线

这种S形曲线体现为，当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度，这是别构酶可以灵活地调节反应速度的原因米氏酶：[S]0.9/[S]0.1=81

别构酶：[S]0.9/[S]0.1=3

表明当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的酶促反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax。当增加正调节物浓度时Km减小，亲和力增大，协同性减小：当增加负调节物的浓度时Km增加，亲和力减小，协同性增大（对底物浓度的反应灵敏度增加）。别构酶动力学曲线图①S型曲线是必要但不充分条件

②脱敏作用

③[S]0.9／[S]0.1

Rs=81米氏酶

Rs＜81正协同

Rs＞81负协同

④Hill系数法

（3）、别构酶调节活性的机理

①序变模型：

酶分子中亚基结合底物后，构象逐个地依次变化。

②齐变模型：

（4）、别构酶的鉴定

[S]v——[S]90%V[S]10%V=81——[S]90%V[S]10%V＜81——[S]90%V[S]10%V＞81（5）、共价调节酶共价调节酶：酶分子被其它的酶催化进行共价修饰，从而在活性形式与非活性形式之间相互转变。

共价调节酶的两种常见类型

①磷酸化去磷酸化-OHATP

②腺苷酰化脱腺苷酰化腺苷酰基由ATP提供

1分子磷酸化酶激酶，活化生成几千个磷酶化酶a

1分子磷酸化酶a，催化生成几千个1-P-G

举例：糖原磷酸化酶信号的级联放大：调节酶图片八、酶活力的测定酶的含量不能直接用重量和摩尔数表示（不纯、失活、分子量不知），而采用酶的活力单位表示

在测定酶活力时必须要注意：（1）测定的反应速度必须是反应初速度，否则不可能得到准确结果。（2）酶反应速度受环境条件的影响。因此在测定酶活力时，要维持在一套固定条件下进行。（1）、酶活力与酶促反应速度研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准。因为底物浓度降低、酶部分失活产物抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的延长而下降。表示方法：单位时间或单位体积中底物的减少量（产物的增加量）

单位：浓度/单位时间

102030405060min产物生成量酶反应进程曲线酶活力：用在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度表示。反应速度快，活力就越高。酶量—酶活力一反应速度（2）、酶的活力单位（U）国际酶学会标准