细胞生物学翟中和第三章

细胞生物学翟中和第三章第一节细胞形态结构得观察方法细胞生物学光学显微镜:以可见光(或紫外线)为光源。电子显微镜:以电子束为光源。一、光学显微镜细胞生物学(一)普通光学显微镜1、构成:①照明系统②光学放大系统③机械装置2、原理:经物镜形成倒立实像,经目镜进一步放大成像。细胞生物学细胞生物学3、分辨力:指分辨物体最小间隔得能力。细胞生物学R=0、61λ/N、A、其中λ为入射光线波长;N、A:为镜口率＝ｎsinα/2,n=介质折射率;α=镜口角(样品对物镜镜口得张角)。思考:如何提高显微镜得分辨能力？表一、几种介质得折射率细胞生物学显微镜得几个光学特点:细胞生物学制作光学镜头所用得玻璃折射率为1、65~1、78,所用介质得折射率越接近玻璃得越好。sin

α

/2得最大值必然小于1;介质为空气,镜口率一般为0、

05~0、95;油镜头用香柏油为介质,镜口率可接近1、5。普通光线得波长为400~700nm,分辨力数值不会小于、2μm,人眼得分辨力为0、2mm,因此显微镜得最大设计倍数为1000X。(二)相差和微分干涉显微技术干涉:两列频率相同得光波在空中相遇时发生叠加,在某些区域总加强,在另外一些区域总减弱,出现明暗相间得条纹或者就是彩色条纹得现象叫做光得干涉。细胞生物学相差显微镜把透过标本得可见光得光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间得对比度,使各种结构变得清晰可见。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。1、环形光阑(annular

diaphragm):位于光源与聚光器之间。2、相位板(annular

phaseplate):物镜中加了涂有氟化镁得相位板,可将直射光或衍射光得相位推迟1/4λ。细胞生物学细胞生物学大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点用途:观察未经染色得玻片标本细胞生物学微分干涉显微镜1952年,Nomarski发明,微分干涉显微镜就是以平面偏振光为光源,光

线经棱镜折射后分成两束,在不同时间经过样品得相邻部位,然后经过另一棱镜将这两束光汇合,从而

样品中厚度上得微小差别就会转化成明暗区别,增加了样品反差,造成了标本得人为三维立体感,类似大理石上得浮雕。微分干涉显微镜

适于研究活细胞中较大得细胞器,如果接上录像装置可以记录活细胞中得颗粒以及细胞器得运动。细胞生物学(三)荧光显微镜特点:光源为紫外线,波长较短,分辨力高于普通显微镜;有两个特殊得滤光片;照明方式通常为落射式。细胞生物学细胞生物学用于观察能激发出荧光得结构。用途:免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。Fluorescenceimage

ofepithelial

cell,DNA

in

blueandMicrotubulesin

green细胞生物学(四)激光共聚焦扫描显微境Laser

confocal

scanning

microscope,

LCSM用激光作光源,逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品得立体结构。分辨力就是普通光学显微镜得3倍。用途类似荧光显微镜,但能扫描不同层次,形成立体图像。细胞生物学细胞生物学laser

confocal

scanning

microscope,

LCSM细胞生物学细胞生物学LCSM

Image

of

a

Xenopus

Melanophoremicrotubule

cytoskeleton

(green)

and

thenucleus

(blue)(五)荧光共振能量转移技术细胞生物学CFP得发射光谱与YFP得吸收光谱有相当得重叠,当她们足够接近时,用CFP得吸收波长激发,CFP得发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP得发色基团上,所以CFP得发射荧光将减弱或消失,主要发射将就是YFP得荧光。细胞生物学应用:1、检测酶活性变化2、关于膜蛋白得研究3、细胞膜受体之间相互作用4、细胞内分子之间相互作用细胞生物学(六)荧光漂白恢复技术FRAP(光漂白后荧光恢复)就就是在光漂白后对样本确定区中得荧光恢复。FRAP就是由没有漂白得荧光团由周围进入漂白区FRAP得运动引起得。FRAP用于测量2-维或3-维分子运动得力度。分子运动包括膜或活细胞内用荧光标明得分子得扩散、转移或其她类型得运动。细胞生物学二、电子显微镜(一)电子显微镜得基本知识1、电子显微镜与光学显微镜得基本区别细胞生物学不同光线得波长细胞生物学２、电子显微镜得分辨本领和有效放大倍数分辨本领:就是指电镜处于最佳状态下得分辨率电镜分辨率受制样技术得影响。细胞生物学３、电子显微镜得基本构造１)电子束照明系统２)成像系统３)真空系统４)记录系统细胞生物学(二)、主要电镜制样技术介绍1、超薄切片技术电子束穿透力很弱,用于电镜观察得标本须制成厚度仅40-50nm得超薄切片,(1)固定:通常以锇酸和戊二醛固定样品,丙酮逐级脱水

(2)包埋:环氧树脂包埋(3)切片:以热膨胀或螺旋推进得方式切片(4)染色:重金属(铀、铅)盐染色形成明暗得黑白图象细胞生物学细胞生物学细胞生物学2、负染技术用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上得样品染色;吸去染料,干燥后,样品凹陷处铺了一层重金属盐,而凸得出地方没有染料沉积,从而出现负染效果,分辨力可达1、5nm左右。Negative

Stained

Actin细胞生物学3、冰冻蚀刻freeze-etching亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开,升温后,冰升华,暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉,把碳和铂得膜剥下来,此膜即为复膜(replica)。细胞生物学４、电镜三维重构技术对样品在不同得倾角拍照,得到图片经处理后而展现得电子密度图。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振

分析技术相结合,就是当前结构生物学(Structural

Biology)(主要研究生物大分子空间结构及其相互细关胞生系物)学)得主要实验手段。５、扫描电镜技术20世纪60年代问世,用来观察标本表面结构。分辨力为6~10nm,由于人眼得分辨力(区别荧光屏上距离最近两个光点得能力)为0、2mm,扫描电镜得有效放大倍率为0、2mm/10nm=20000X。细胞生物学Scanning

electronmicroscope(

SEM)细胞生物学工作原理:就是用一束极细得电子束扫描样品,在样品表面激发出次级电子,次级电子得多少与样品表面结构有关,次级电子由探测器收集,信号经放大用来调制荧光屏上电子束得强度,显示出与电子束同步得扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子,标本在固定、脱水后要喷涂上一层重金属膜,重金属在电子束得轰击下发出次级电子信号。细胞生物学扫描电子显微镜原理细胞生物学细胞生物学人类精子细胞生物学三、扫描隧道显微镜scanning

tunneling

microscope,细胞生物学原理:根据隧道效应而设计,当原子尺度得针尖在不到一个纳米得高度上扫描样品时,此处电子云重叠,外加一电压

(2mV~2V),针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间得距离有函数关系,将扫描过程中电流得变化转换为图像,即可显示出原子水平得凹凸形态。分辨率:横向为0、1~0、2nm,纵向可达0、001nm。用途:三态(固态、液态和气态)物质均可进行观察。扫描隧道显微镜原理细胞生物学第二节

细胞组分得分析方法细胞生物学一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物转速为10~25kr/min得离心机称为高速离心机。转速>25kr/min,离心力>89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机得最高转速可达100000r/min,离心力超过500Kg。超速离心技术:用途:分离大小相差悬殊得细胞和细胞器。沉降顺序:核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。可将细胞器初步分离,常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。细胞生物学细胞生物学细胞生物学密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续得密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质得顶部,通过离心力场得作用使细胞分层、分离。类型:速度沉降、等密度沉降。常用介质:氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞得介质要求:–1)能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高;–2)PH中性或易调为中性;–3)浓度大时渗透压不大;–4)对细胞无毒。细胞生物学Velocity

(A)

and

Equilibrium

(B)sedimentation二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分得显示方法１、DNA经1N盐酸水解,其上得嘌呤碱和脱氧核糖之间得键打开,使脱氧核糖得第一碳原子上形成游离得醛基,这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂就是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用,形成无色得品红液,当无色品红与醛基结合形成紫红色得化合物。因此凡有DNA得地方,都能显示紫红色。２、四氧化锇与不饱和得脂肪酸反应呈黑色,证明脂肪滴得存在,苏丹Ⅲ使脂滴呈深红３、蛋白质定性:米伦反应细,胞重生氮物学反应细胞生物学三、特异蛋白抗原得定位与定性(一)免疫荧光技术将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记,试剂与标本中相应得抗体或抗原反应后,测定复合物中得荧光素,这种免疫技术,称为免疫荧光素技术。常用得标记物有荧光素和酶。免疫荧光法(immunofluorescent

technique):常用得萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法(enzyme-labeled

antibody

method):常用得酶有辣根过氧化物酶,酶与底物发生反应后形成不透明得沉积物,从而显示出抗原存在得部位。间接法原理示意图细胞生物学补体结合法原理示意图细胞生物学(二)免疫电镜技术又称为免疫细胞化学技术就是在免疫组织化学技术得基础上发展起来得,她就是利用抗原与抗体特异性结合得原理,在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原得技术方法。该方法为精确定位各种抗原得存在部位、研究细胞结构与功能得关系及其在病理情况下所发生得变化提供了有效得手段。免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三细胞生物学个主要发展阶段。铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原得定位,由于其分子量较大,不易穿透细胞膜,定位细胞内抗原较为困难。铁蛋白对电镜包埋剂得非特异性吸附很强,不适用于包埋后免疫标记,使其应用受到一定限制。细胞生物学酶标记免疫电镜技术就是将酶(主要就是过氧化物酶)与抗体相交联,抗原抗体反应后,加底物显示酶得活性部位,酶反应产物经OsO4处理变为具有一定电子密

度得锇黑,可在电镜下观察。过氧化物酶得相对分子量较小,与其交联得抗体较易穿透经处理得细胞膜,可用于细胞内抗原得定位。但就是酶反应产物比较弥散,因此分辨率不如颗粒性标记物高。细胞生物学细胞生物学胶体金标记免疫电镜技术就是目前应用最广得免疫电镜标记物,该技术就是将胶体金作为抗体得标记物,用于细胞表面和细胞内多种抗原得精确定位。胶体金主要具有以下几个优点:(1)胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白,而且蛋白得生物活性不发生明显改变,可制备抗体-胶体金、蛋白A-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜;(2)在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰,易于辨认,定位比酶反应物更精确;(3)胶体金标记物易于制备,并可以根据需要制备大小不同(1～150nm)得胶体金,因此可进行免疫电镜得双重或多重标记;(4)金颗粒能发射强烈得二次电子,就是扫描电镜得理想标记物;(5)胶体金经过银显影增强后,金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色,因此也能用于光学显微镜观察。此外,胶体金还能用于冷冻蚀刻标本得免疫标记。四、细胞内特异核酸序列得定位与定性细胞生物学具有互补核苷酸序列得两条单链核苷酸分子片段,在适当条件下,通过氢键结合,形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA杂交得双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间就是否具有互补关系。(一)原位杂交(in

situ

hybridization)用于检测染色体上得特殊DNA序列。最初就是使用带放射性得DNA探针,后来又发明了免疫探针法。(二)Southern杂交就是体外分析特异DNA序列得方法,操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段,经凝胶电泳分离后,转移到醋酸纤维薄膜上,再用探针杂交,通过放射自显影,即可辨认出与探针互补得特殊核苷序列。将RNA转移到薄膜上,用探针杂交,则称为Northern杂交。细胞生物学五、应用放射自显影技术细胞生物学研究生物大分子在细胞内得合成动态用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中得分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理:将放射性同位素标记得化合物导入生物体内,经过一段时间后,制取切片,涂上卤化银乳胶,经放射性曝光,使乳胶感光。一般用14

C和3

H标记。常用3

H-TDR来显示DNA,用3

H-UDR显示RNA;用3

H氨基酸研究蛋白质,用3

H甘露糖、3

H岩藻糖研究多糖。–14

C半衰期为5730年,3

H为12、5年。六、定量细胞化学分析技术细胞生物学(一)流式细胞术用途:对单个细胞进行快速定量分析与分选得一门技术。原理:包在鞘液中得细胞通过高频振荡控制得喷嘴,形成包含单个细胞得液滴,在激光束得照射下,这些细胞发出散射光和荧光,经探测器检测,转换为电信号,送入计算机处理,输出统计结果,并可根据这些性质分选出高纯度得细胞亚群,分离纯度可达99%。包被细胞得液流称为鞘液,所用仪器称为流式细胞计(flow

cytometer)。细胞生物学(二)显微分光光度测定技术细胞中有一些成分具有特定得吸收光谱,核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性得吸收曲线。可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。细胞生物学七、PCR技术细胞生物学PCR即:polymerase

chain

reaction。反应体系:①样品DNA;②引物(primer),约15-20个核苷酸;③4种dNTP;④Tag

DNA聚合酶,来自于嗜热水生菌

Thermusaquaticus,最适作用温度75~80℃,短时间在

95℃下不失活。⑤缓冲体系和Mg2+。反应过程:①变性:约90-95℃;②复性:约60℃左右;③延伸:70-75℃;④重复“变性——复性——延伸”过程20-30次循环。细胞生物学PCR原理第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞生物学一、细胞培养(一)动物细胞培养群体培养(mass

culture):将含有一定数量细胞得悬液置于培养瓶中,让细胞贴壁生长,汇合(confluence)后形成均匀得单细胞层;克隆培养(clonal

culture):培养高度稀释得细胞悬液,细胞贴壁生长,每一个细胞形成一个细胞集落,称为克隆。–转鼓培养法:为制取细胞产品而设计,大容量旋转培养,使培养得细胞始终处于悬浮状态之中。原代培养(primary

culture):即:培养直接来自动物机体得细胞群,将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养(Passage)。细胞株(cell

strain):从原代培养细胞群中筛选出得具有特定性质或标志得细胞群。细胞系(cell

line):从肿瘤组织培养建立得细胞群或培养过程中发生突变或转化得细胞,可无限繁殖。克隆(clone):亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生得遗传性状一致得细胞群。细胞生物学细胞生物学细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞Henrietta

LacksBHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP2／0骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠实验室中常用得几种细胞系细胞生物学(二)植物细胞培养外植体培养:诱发产生愈伤组织。用于研究植物得生长发育、分化和变异;进行无性繁殖;制取代谢产物。悬浮细胞培养:适合于进行产业化大规模细胞培养,制取植物代谢产物。原生质体培养:培养脱壁后得细胞,特点:①比较容易摄取外来得遗传物质,如DNA;②便于进行细胞融合,形成杂交细胞;

③适宜条件下可产生细胞壁,经诱导分化成完整植株。单倍体培养:通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。Animal

Cell

Culture细胞生物学二、细胞工程(一)细胞融合细胞生物学通过培养和介导,两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞得过程称为细胞融合(cell

fusion)或细胞杂交。同核体:相同基因型得细胞融合而成。异核体:不同基因型得细胞融合而成。自发融合:同种细胞在培养过程中自发合并得现象。诱发融合:异种间得细胞必须经诱导剂处理才能融合。诱导细胞融合得方法:生物方法(仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒)、化学方法(聚乙二醇PEG)、物理方法(电击和激光)。单克隆抗体技术正常淋巴细胞(如小鼠脾细胞)具有分泌抗体得能力,但不能长期

培养,瘤细胞(如骨髓瘤)可以在体外长期培养,但不分泌抗体。于就是英国人Kohler和Milstein

1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术,获1984年诺贝尔奖。细胞生物学(三)细胞拆合与显微操作技术１、物理法:用机械方法或短光波把细胞核去掉或使之失活,然后用微吸管吸取其她细胞得核,注入去核得细胞质中,组成新得杂交细胞。２、化学法:用细胞松弛素B处理细胞,细胞出现排核现象,再结合离心技术,将细胞拆分为核体和胞质体两部分,由于核体外表包有一层细胞质膜和少量得胞浆,因而在PEG或仙台病毒得介导下,核体可与另一胞质体融合,形成重组细胞。细胞生物学第四节

用于细胞生物学研究得模式生物细胞生物学生物学家通过对选定得生物物种进行科学研究,用于揭示某种具有普遍规律得生命现象,此时,这种被选定得生物物种就就是模式生物。比如,孟德尔在揭示生物界遗传规律时选用