第七章高效液相色谱法教材课件

第七章高效液相色谱法（HPLC）7.1概述7.1.1两个比较（1）与经典液相色谱比较

相同点:分析原理相同主要差别：固定相的性质、形状、粒度经典：>10µm的全多孔吸附剂，不均匀，不耐高压，操作方式为间断式，速度慢。（2）HPLC与GC比较

主要差别：作为流动相的液体和气体之间的性质差别。GC分析对象：挥发性和热稳定性高的物质（约20％的有机物）流动相：种类少，但组分没有作用力操作条件：恒温，压力小LC不受分析对象热稳定性的限制种类多对分离起很大作用室温，高压7.1.2高效液相色谱法的分类（1）液－液分配色谱（LLC）

不同组分在固定相与流动相中的分配系数差异进行分离。固定相：涂渍在担体表面或键合到担体上的固定液。正相色谱固定相：极性物质流动相：非极性或弱极性物质反相色谱固定相：极性小的物质流动相：极性大的物质（水系溶剂）应用：分离不同类化合物或同系物,

对分离异构体不优越,固定相的种类多，用途广.性能：重现性佳，溶质保持稳定（2）液固吸附色谱（LSC）

基于不同组分吸附能力的差异而进行混合物的分离。应用：适于分离不同类化合物或异构体。不适宜分离同系物，固定相的种类少，应用不十分广泛。固定相：极性吸附剂流动相：弱极性的有机溶剂性能：重现性能差，样品有时会异构化解。（3）离子色谱根据离子交换树脂对组分的亲和力不同而进行分离。固定相：离子交换剂流动相：多为缓冲溶液应用：一般用于分离离子型化合物（4）分子排阻色谱按分子的尺寸大小进行分离。凝胶过滤固定相：亲水性凝胶流动相：水系溶剂凝胶渗透固定相：疏水性凝胶流动相：有机溶剂应用：

①分离分子量大于2000的物质

②测高聚物分子量分布③分离各种大分子（蛋白质，核酸）7.2高效液相色谱仪7.2.1流动相输送系统

流动相输送系统由过滤器、储液装置，脱气装置，高压泵、压力脉冲阻尼器、梯度淋洗装置组成。脱气装置：抽真空或吹入惰性气体的装置仪器外脱气:低压脱气（抽真空）、超声波脱气阻尼器：螺旋毛细管、波纹管等(稳定液流)过滤器：孔径约为2µm的多孔性烧结不锈钢过滤器或特种烧结玻璃过滤器.在线脱气:真空脱气7.2.2高压输液泵（1）对泵的要求①输出压力高;②流量范围宽;③流量稳定，无脉冲;④耐腐蚀。（2）泵的种类①恒流泵（往复泵，注射泵）输出流量稳定，与外界阻力变化无关，为保护泵，设有最高压力限制装置。②恒压泵（气动放大泵）输出压力恒定，流量随色谱体系的压力而变化。保留时间重现性差，较少应用。7.2.3梯度洗脱装置（1）低压梯度洗脱装置（外梯度）

常压下溶剂按一定比例混合后再由高压泵输入色谱柱。（2）高压梯度洗脱装置（内梯度）

由两台或三台高压泵，梯度程序控制器组成。各台泵将不同溶剂送入混合器，经充分混合后进入色谱柱。7.2.4进样系统直接注射进样，进样阀，自动进样系统六通阀动画7.3.5检测器类型溶质性质检测器：仅对溶质的物理性质或物理化学性质有响应（紫外、荧光检测器）总体性质检测器：测量流动相中总的物理性质变化（差示折光，电导电检测）（1）紫外检测器光源氘灯：190－350nm连续波长氢弧光灯：200－300nm连续波长低压：254nm汞灯中压：280nm光谱通带：2－5nm池体池长：一般为10mm直径：Φ＝1mm池体积：8µL左右池材料：石英光接收元件：光敏电阻，光电管或光电倍增管。光源参比池光敏电阻1测量池光敏电阻2

若两池通过的都是纯流动相，则两光敏电阻接收的辐射强度相等，无信号输出。吸光度：当组分进入测量池时，吸收紫外辐射，两光电阻接收的辐射强度不等，有信号输出。优点灵敏度高（10-9g·mL-1）选择性好线性范围宽（10-5－10-8）对温度不敏感适于梯度洗脱光二极管阵列检测器由1024(512或211)个光电二极管组成,各检测特定波长;计算机快速处理，可同时检测180~600nm波长范围内全部紫外光和可见光波的信号.可获得A-λ-t三维立体色谱图.(2)差示折光检测器测量参比池和样品池之间的折射率之差n1－溶剂的折射率n2－溶质的折射率c1－溶液中溶剂的浓度分数c2－溶液中溶质的浓度分数溶液的折射率：ns=n1c1+n2c2c1+c2=1ns-n1=n1c1+n2c2-n1=n1(1-c2)+n2c2-n1=c2(n2-n1)

一定稀溶液：折射率之差（ns-n1)c2优点：适用性好缺点：①灵敏度较低(10-6g·mL-1)②不能用于梯度洗脱③折光率对环境温度敏感，要求恒温精度±0.001℃。

对于无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。(3)荧光检测器（FLD）氙闪光灯透镜平面镜激发单色器透镜样品光电二极管光电倍增器发射单色器测量溶质受紫外光照射发生的荧光能量荧光强度∝组分浓度应用：测量在紫外线照射下能发出荧光的物质优点：①检测限低（10-12g·mL-1）②选择性强（4）电化学检测器

检测具有电活性的物质，如含有硝基、氨基的有机化合物及无机阴、阳离子。优点：①灵敏度高（10-9g）②选择性高③结构简单7.3色谱柱7.3.1柱材质与结构材料：不锈钢、氟塑料要求：耐高压，抗腐蚀，精密管径，内壁抛光长度：一般150－250mm，少量30mm短柱，

500mm长柱内径：一般4－5mm，标准柱径：4.6mm，痕量分析<3mm，凝胶色谱柱：8mm7.3.2固定相的种类①刚性固体以SiO2为基质，表面键合各种官能团，可以承受压力70－100MPa.可用于分配色谱，吸附色谱，凝胶色谱缺点：只能在pH＝2

7.5条件下使用，碱度过大，硅胶容易粉碎溶解，pH太低，连结有机基团的化学键易断裂。优点：机械强度大，化学稳定性好，容易控制孔结构和表面积。（1）按承受的压力分类②硬胶（高分子微球）

聚苯乙烯与二乙烯苯交联而成，改变制备方法可以得到各种刚性和孔隙度不同的硬胶，承受压力上限为35MPa。可用于离子色谱和离子交换色谱，凝胶渗透色谱。

缺点：不同溶剂收缩率不同，柱效较硅胶微粒低优点：化学惰性好，可在pH＝1

14范围使用③软胶葡聚糖，琼胶糖等用于凝胶过滤色谱中分离水溶性物质。（2）按表面形状分①表面多孔：基体是实心玻珠，外覆活性多孔材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂等，多孔表层薄，孔浅，传质快，柱效高.缺点：柱容量小，已较少使用。②全多孔型：比表面积大,粒径3-5µm，柱容量高，保留值大。缺点：由于孔深，传质阻力大，所以10µm以上柱效低。（3）化学键合相

化学键合相是通过化学反应将固定液键合到载体上。优点减弱了表面活性作用点耐溶剂冲洗热稳定性好表面改性灵活反应类型：①Si－O－C键型（硅胶与醇类反应生成硅酸酯）因为在水、醇存在下有水解，醇解的可能，所以只能在正相条件下使用。②Si－N键型（硅胶与胺类的反应产物）③Si－C键型（硅胶与卤代烷反应产物）可用于非或强极性溶剂作流动相，使用水溶液时，必须限制在pH48范围内④Si－O－Si－C（硅胶与有机硅烷反应产物）

这类固定相是将硅胶表面用有机氯硅烷或烷氧基硅烷处理。最常用的十八烷的键合形式可表示如下：

通过硅烷化反应导入的基团可以是从强极性到非极性的官能团，如十八烷基、辛烷基（C8）、氨基、氰基、苯基等.键合的表面可以是单分子层、也可以被多分子聚合物覆盖。7.3.3色谱柱的填充方法（1）干法适于颗粒大小在20μm以上的硬胶固定相（2）匀浆法

当固定相的颗粒直径<20μm时，用干法装柱时，固定相按直径大小聚集及表面静电排斥作用，不易装填和获得干柱效，故应采用匀浆法。

做法：用一种密度与颗粒密度接近或粘度很高的匀浆溶液，制备固定相5％－20％的等密度悬浮液，然后装柱。7.3.4柱的保养①溶剂用0.5μm孔径的过滤器处理，防止柱堵塞；⑤含有强烈滞留组分的样品应使用保护柱。②柱的实际操作压力应低于填装时的最高，最好在最高压力的一半以下；③防止反冲（流动相逆向流动），否则固定相层位移，柱效下降；④使用完柱子后用纯有机溶剂清洗，并将柱子保存在纯有机溶剂中；7.4流动相及其选择基本保留方程式：流动相性质直接影响流动相的选择对分离起着极其重要的作用7.4.1对溶剂的要求（1）化学稳定性好，不与固定相互溶，不发生不可逆反应;（2）纯度高;（3）对给定的样品有合适的极性和良好的选择性;（4）适合于所使用的检测器;（5）粘度低;7.4.2溶剂强度及选择

溶剂强度－流动相将组分从固定相上洗脱下来的能力对给定的组分：与色谱分离过程密切相关的最重要的溶剂特性参数则有溶剂强度参数

0、溶解度参数

、极性参数P

（1）吸附色谱中的溶剂强度①溶剂强度与溶剂强度参数a.吸附剂强度参数吸附色谱的溶剂强度以溶剂强度参数表示

规定：对氧化铝吸附剂，正戊烷，其余溶剂的相对大小与正戊烷的相比较。定义为溶剂分子在单位吸附表面积A上的吸附自由能，表征了溶剂分子对吸附剂的亲和程度。

0越大，k

越小，所以溶剂强度参数序列可作为吸附色谱的洗脱系列表：氧化铝吸附剂上的溶剂强度参数溶剂溶剂正戊烷0.00甲苯0.29石油醚0.01丙酮0.56环己烷0.04乙腈0.65二硫化碳0.15甲醇0.95四氯化碳0.18乙二醇1.1

b.对不同的吸附剂，的绝对值不同，但相对强度变化不大。因为氧化铝、硅胶是极性物质，流动相的极性小于固定相，所以溶剂强度随着溶剂极性的增加而增大。c.不同样品的类型、洗脱类型相近（2）二元混合溶剂的应用

分离复杂混合物时，常采用二元混合溶剂溶剂A与溶剂B以不同比例混合时，混合溶剂的可以在纯A的和纯B的之间变化。

溶剂序列硅胶吸附剂氧化铝吸附剂0戊烷戊烷0.053％二氯甲烷/戊烷1.5％二氯甲烷/戊烷0.107％二氯甲烷/戊烷4％二氯甲烷/戊烷0.1514％二氯甲烷/戊烷8％二氯甲烷/戊烷0.2026％二氯甲烷/戊烷13％二氯甲烷/戊烷0.3082％二氯甲烷/戊烷34％二氯甲烷/戊烷0.353％乙腈/苯54％二氯甲烷/戊烷0.4011％乙腈/苯84％二氯甲烷/戊烷讨论：正戊烷混合溶剂强度与极性溶剂组分的变化关系

近似强度可有几种不同的搭配

如26％苯/戊烷，k’合适，但α=1

不能分离，改用21%氯代异丙醇/戊烷，相同。但氯代异丙烷的极性大于苯，可令α变大，改善分离。75%二氯甲烷-戊烷48％乙醚-戊烷1.9%乙腈-戊烷0.3％甲醇-戊烷50％二氯甲烷-异丙基氯36％乙醚-异丙基氯16％乙腈-异丙基氯0.2％甲醇-异丙基氯经验规则：①极性强的B组分浓度很高或很低时，有最大的α值;②能与溶质发生氢键作用的溶剂，有较好的分离选择性;③在流动相中加入缓和剂.作用：①改善组分保留值的重现性;②拖尾减少，柱效增加;③使样品的线性容量增加;④减小吸附剂对样品的催化作用和不可逆吸附.（3）分配色谱的溶剂强度及溶剂选择①溶解度参数δ溶解度参数δ是分配色谱溶剂强度的量度尺度，溶剂的极性增↗，δ↗海德布瑞第（HilderbrandIH）提出的表示溶剂极性的参数是从分子间作用力的角度考虑，表示1mol理想气体冷却变成液体时所释放的凝聚能Ec与液体摩尔体积Vm比值的平方根。根据δ值，可以比较流动相的强度以控制k’值正相色谱：δ增大，流动相强度增加，溶质的k’减小反相色谱：δ增大，流动相强度减小，溶质的k’增大

δ是溶剂与溶质分子之间四个特殊作用力的总量度δδd:色散溶解度参数δ

0：偶极取向溶解度参数δ

a：溶剂接受质子溶解度参数δ

h：溶剂给质子溶解度参数表：部分色谱溶剂的溶解度参数溶剂δδdδ0

δaδh正己烷7.37.30000.01乙醚7.46.72200.38四氯化碳8.68.600.500.18甲苯8.98.900.500.29三氯甲烷9.18.130.500.40丙酮9.46.852.500.56二氯甲烷9.66.45.50.500.42乙腈11.86.582.500.65甲醇12.96.257.57.50.95水216.3大大大δd大，极化度大的物质（如芳香族）优先作用δ

0大，具有较大偶极矩者（腈，硝基化合物）优先作用δ

a大，给质子能力大者（含羟基的酚、醇）优先作用δ

h大，按接收质子能力大者（胺、亚砜）等优先作用

作用力大的优先分配在流动相，k’值小在考虑一般的溶剂序列时，必须兼顾四个参数的变动情况。

不同化合物，与溶剂作用时以某一种力为主，各种溶解度参数各代表一个不同类型溶剂的量度。例：甲醇乙腈丙酮δ12.911.89.4甲醇>乙腈>丙酮δ

d6.26.56.8接近δ0585乙腈>甲醇＝丙酮δa7.52.52.5甲醇>乙腈＝丙酮δh7.500甲醇>乙腈＝丙酮

当分离萘、硝基萘时，主要是极性作用力，乙腈强于甲醇；分离酚类物质时，主要是氢键作用力，甲醇强于乙腈。溶质的强度：由δ支配

溶剂的选择性：由δd，δ

0，δ

a，δ

h决定混合溶剂的δ，δd，δ

0，δ

a，δ

h是组成混合溶剂的各种纯溶剂相应的δ的平均值。在保证1K10的前提下（在一定范围内），通过选择d、o、a、h不同的试剂来改善分离选择性②溶剂极性参数P’

溶剂极性参数是溶剂极性的另一尺度，是Sngder使用Rohrschneider的溶解度参数数据推导出的。P’＝log（Kg’’）乙醇+log(Kg’’)二氧六环+log(Kg’’）硝基甲苯式中：Kg’’－与溶剂的汽化自由能成正比的极性分布系数P’由乙醇、二氧六环、硝基甲苯分别作溶质时的溶解度数据计算得到。每种溶质的Kg’’值与P’的比值称为选择性参数。Sngder规定的选择性参数为：P’增大，溶剂极性增加正相色谱：P’增大，溶剂强度增加，样品K’减小反相色谱：P’增大，溶剂强度减少，样品K’增大

例：反相色谱中，流动相从30％（V/V）甲醇－水改变为40％（V/V）甲醇－水，问组分的调整保留值改变多少？（已知甲醇的p’值为5.1，水的p’值为10.2）③溶剂的选择Sngder以等边三角形的三条边代表xe,xd,xn三个参数。按每种溶剂的xi值在三角形内找到相应的点，发现选择性相似的溶剂集中在一个小区域（圆圈）内，将各个圆圈的溶剂归成一组，共分成八组。如果溶剂－样品的主要作用力变化,则溶剂的选择性有明显的变化.溶剂分类I脂肪族醚、三级烷胺II脂肪醇III四氢呋喃、吡啶、二甲基甲酰胺、二甲亚砜IV乙二醇、乙酸、甲酰胺V二氯甲烷、1,2-二氯乙烷,VI乙腈、乙酸乙酯、二氧六环,脂肪族酮VII苯、甲苯、二甲苯、硝基甲烷、硝基乙烷、甲乙酮VIII氯仿、水

同一组内的溶剂有相似的选择性，但极性可能相差很大。不同组间极性相似的溶剂，选择性可能相差很大。例：P’XeXdXn选择性甲醇5.10.480.220.31Ⅱ丙酮5.10.350.230.42Ⅵ

甲醇：质子受体丙酮：偶极作用力寻找最佳溶剂的方法：①选择合适的p’值，使k’在最佳范围。②考虑溶剂的选择性例：正相色谱分离某一样品，以20％（V/V）氯仿－己烷作流动相，溶剂强度合适，但分离情况不佳。改变溶剂的选择性，必须使选择性组的位置有较大的变化。氯仿属Ⅷ组，距离较远的有Ⅰ，Ⅴ组。

若以Ⅴ组的二氯甲烷代替氯仿，混合溶剂的极性应维持不变。即：（3）离子交换色谱流动相

大多数离子交换色谱以盐类的缓冲溶液为流动相，某些特殊的情况下也加入有机溶剂。在离子交换色谱中，交换反应可表示如下：

当溶液中有多种离子同时存在时，不同离子对树脂可交换的基团进行竞争，即发生不同离子间的交换反应：影响溶质k’值的因素：①pH的影响离子交换分离的对象是一些可电离的化合物。流动相的pH值影响样品的电离，从而影响样品的保留值。对于弱酸组分，采用阴离子树脂作为固定相。在阳离子树脂上：pH值是通过影响溶质中可交换离子的浓度来影响k’值。所以pH值对弱酸、弱碱样品影响大，对强酸、强碱样品影响小。②溶剂离子强度的影响

缓冲溶液或其它盐的浓度增大，溶剂离子强度增大，对交换剂上的离子基R-或R+竞争力增强，样品离子的竞争力下降，保留值下降。因为样品中阳离子的量极少（<树脂总容量的2％），树脂上吸附的主要是洗脱剂的阳离子。③不同离子的影响

缓冲溶液离子类型不同，与树脂的亲和力不同，洗脱能力不同。

例：阳离子与树脂的亲和力顺序：K+>NH4+>Na+>H+,

阴离子与树脂的亲和力顺序：柠檬酸根>SO42->C2O42-

洗脱能力：钾盐缓冲溶液比钠盐缓冲能力快

（4）分子排阻色谱的流动相

不能借助改变流动相来改善分离。流动相的选择主要考虑：①能够很好溶解样品和有低的粘度②与检测器和固定相匹配常用的流动相：四氢呋喃、甲苯、氯仿、水等。7.4.3改善分离的一