白化转绿型色叶标记的玉米抗水稻栽培新系

白化转绿型色叶标记的玉米抗水稻栽培新系

石明松发现，自58s光面栽培以来，这两种杂交水稻育种取得了很大进展。迄今为止,许多光温敏核不育系先后通过了正式鉴定,如培矮64S、广占63S等。由于育性易受异常天气的影响而出现回复,光温敏雄性核不育系育性的稳定性很大程度上决定了制种生产风险系数。即便是育性较为理想的培矮64S,也会因无法预测的异常天气引起较严重的育性回复,导致杂种F1纯度不同程度的下降。在此背景下,不育系的育性回复问题已成为限制两系杂交水稻深入发展的重大障碍。针对上述问题,目前提出了以下4种主要解决的策略或方法:核心种子技术与遗传提纯法、化学杀雄法、生理调控法和标记去杂法。其中,标记去杂法按选用的标记类型不同,又有致死标记、转基因抗除草剂和叶色标记等3种技术。从可操作性的角度看,叶色标记技术最为直观、经济可行,不涉及基因产权保护和转基因生物安全性评价。有关杂交水稻叶色标记的研究,国内已有较多的报道。任光俊等首先将紫色叶基因通过杂交和回交的方法转育到不育系上作为标记性状。牟同敏等研究认为,紫叶性状可作为标记用于杂交水稻育种。董凤高等采用杂交和回交方法将浅绿色叶基因导入籼型温敏核不育系,选育了光温敏核不育系M2S。曹立勇等采用相同的方法选育了携带紫色叶标记的光温敏核不育系中紫S。余新桥等以带有淡绿叶标记的光温敏型核不育水稻M2S为供体,以优质早籼保持系中红B为母本杂交,选育了带淡绿叶标记的不育系标-1A。然而,特别值得一提的是,现已选育的带叶色标记不育系的标记均全生育期表达,由于光合作用弱,可能将不同程度地影响不育系本身的农艺性状及其繁、制种产量。本研究以光温敏核不育系培矮64S为材料,采用60Co-γ射线辐照处理,选育了一个苗期携带完全白化、后期转绿的新颖叶色标记的不育系——玉兔S。该不育系保持了原亲本培矮64S的优良特性,携带的隐性白化转绿型叶色标记不影响成熟期的农艺性状,以此为识别手段可方便地进行杂种纯度检测。玉兔S已于2003年8月26日通过了浙江省科技厅组织的成果鉴定。1材料和方法1.1杂交水稻工程技术中心选育试验起始材料为光温敏核不育系培矮64S,由国家杂交水稻工程技术中心选育。培矮64S系我国主栽的两系不育系,与完成测序的优异恢复系9311配制了杂交新组合两优培九,表现优质高产,正在推广种植。1.2射线辐照处理取培矮64S干种子,调节种子含水量至13.5%,在浙江大学辐照中心进行60Co-γ射线辐照处理。辐照剂量300Gy,剂量率10Gy/min。将辐照的种子浸种催芽后直播,成熟时,混收所有的M1植株种子,直播M2群体,于2叶1心时观察叶色突变,选留1~3叶完全白化、后期转绿存活的幼苗,单独移入大田,收获M3种子以作深入筛选鉴定。1.3补偿性生理机制对玉米生长中的酶活性取玉兔S和培矮64S成熟饱满种子各1000粒,3次重复,按相同的方法浸种、催芽、播种,调查幼苗1~6叶期的苗高和分蘖动态。当幼苗生长至6~7叶(约30d秧龄)时,移入大田,按随机区组设计种植。成熟时,随机从各群体选10个单株,考察株高、有效分蘖、穗长、每穗总粒数、千粒重和播抽历期等农艺性状。针对玉兔S苗期弱、后期正常生长的补偿性生理机制,测定了幼苗、分蘖、拔节、开花和成熟期等生长阶段叶绿体内2种与光合作用相关的腺苷酸激酶和RuBP羧化酶的活性。其中,腺苷酸激酶的活性分析按Kleczkowski和Randali的方法,RuBP羧化酶的活性分析按Polishchuck的方法。配合力分析时,采用人工授粉的方法分别获得玉兔S/9311和培矮64S/9311杂种F1,对比株高、有效分蘖、穗长、每穗总粒数、千粒重、播抽历期、产量等主要农艺性状的差异。1.4花粉育性和套袋自交无砂药物的实验2001年4~7月采用分期播种的方法调整不育系的抽穗时间,于7月24日~10月5日每隔2d追踪对比调查玉兔S及其亲本培矮64S的花粉育性和套袋自交结实率。试验时,随机选取10个单株,各套袋1~2个稻穗,并从每穗的上、中、下各取小花1朵。镜检时,混合每朵小花的花粉,用涂抹法检查花粉育性,即先用70%酒精固定花药,后用1%的I2-KI溶液染色后镜检。不育系人工气候室的光温反应鉴定委托中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室进行。1.5中心测定中心测定不育系玉兔S的品质分析依据农业部部颁标准NY20-1986,委托中国水稻研究所稻米及制品质量监督检测中心测定。淀粉粘滞性分析按AACC(美国谷物化学协会)规程(199561-02)要求,采用澳大利亚NewportScientific仪器公司生产的RVA(RapidViscoAnalyzer,Model3-D)快速测定,以TCW(ThermalCycleforWindows)配套软件分析。1.6分离fps群体观察将玉兔S与原亲本培矮64S正反交和恢复系9311杂交,获得杂种F1,自交获取分离F2群体。种植F1和F2,于苗期2叶1心时观察叶色变化情况,并进一步跟踪观察F3验证叶色分离情况。同时,以上述群体为基础,利用Cornell大学发展的SSR标记开展白化转绿型叶色标记的分子定位研究。2结果与分析2.1突变株的鉴定1998年以培矮64S干种子为起始材料,经300Gy的60Co-γ射线辐照处理。冬季直播于海南省陵水县,混收M1植株的所有种子。1999年春,在浙江大学华家池校区实验农场直播M2群体,于2叶1心时筛选叶色白化变异株,选留苗期白化、后期转绿的单株,单收存活株种子。冬季于海南陵水鉴定M3突变的稳定性,剔除农艺性状差的株系并繁殖种子。2000年春季,于浙江杭州进一步鉴定M4突变系,考察不育特性。2001年正季,评价M5突变系的杂种图1携带白化转绿型叶色标记光温敏核不育系玉兔S选育示意图Fig.1.BreedingpedigreeofPTGMSlineYutuSlabeledwithgreen-revertiblealbinoleafmarker.优势和稻米品质,入选优异突变系a-18,定名为“玉兔S”。2002年正季,送中国水稻研究所人工气候箱鉴定,并选育强优势杂交新组合“越优1号(玉兔S/NHR1)”。2003年,组织鉴定玉兔S,并推荐杂交新组合越优1号参加浙江省区域试验。具体的选育过程见图1。2.2特点：兔子s的特点2.2.1黄树叶片及幼苗生长情况玉兔S的第1~3幼叶表现白化,第4叶开始转绿,第6叶恢复至正常绿色。移栽后少数分蘖叶仍表现部分白化,与主茎叶一样也存在一个明显的转绿过程。总的生长特性方面,白化转绿型标记的表达显著影响幼苗的生长,表现为幼苗明显矮小,移栽前基本无分蘖(图2),转绿以后植株生长正常,成熟期的主要农艺性状与原亲本相仿(表1)。与恢复系9311配制的杂种F1优势对比表明,白化转绿型标记对杂种优势无影响。对玉兔S苗期弱、后期正常生长的补偿性生理机制研究表明,在幼苗和成熟阶段,玉兔S叶绿体内腺苷酸激酶和RuBP羧化酶活性与培矮64S相仿,但在分蘖、拔节和开花阶段,其腺苷酸激酶和RuBP羧化酶活性比培矮64S更高,尤其是拔节和开花阶段(图3),但在玉兔S配制的杂种F1与培矮64S配制的杂种F1两者之间未发现显著的差异。因此,白化转绿型标记对后期生长基本无影响可能与其分蘖、拔节和开花阶段光合作用关键酶的活性较高有关。2.2.2ph,pt,tfp育性观察表明,玉兔S的花粉育性和套袋自交结实率均与原亲本培矮64S相仿,在高温长日条件下表现高度不育,在低温短日下表现为部分可育(图4)。人工气候箱的光温反应鉴定表明,玉兔S在NT表示未测。NTstandsfornon-testing.PH,Plantheight;PT,No.ofproductivetillersperplant;PL,Paniclelength;TFP,Totalgrainsperpanicle;SSR,Seedsettingrate;SER,Stigmaextrusionrate;GW,1000-grainweight;YP,Yieldpotentialperplant;GD,Daysfromsowingtoheading.28℃光照14.5h的条件下自交结实率为零(表2)。2.2.3性能测定结果依据NY20-1986《优质食用稻米》标准,玉兔S检验的12项指标中碱消值(5.8)、直链淀粉(21.2%)、蛋白质(15.7%)等3项指标符合一级标准,整精米率(56.5%)、粒长(6.0mm)、长宽比(2.8)、透明度(2)、胶稠度(46mm)等5项指标符合二级标准。RVA测定表明,玉兔S及它与恢复系9311配制的杂交组合的淀粉粘滞性均与培矮64S及其相应的杂交组合相仿(图5)。经浙江省农业科学院植物保护研究所鉴定,玉兔S的抗病性和培矮64S相仿,对稻瘟病和白叶枯病抗性均较好(表3)。从以上分析可知,玉兔S的农艺性状、育性特征、配合力、抗病性、自交结实率均与培矮64S相仿。米质以及稻瘟病和白叶枯病抗性与培矮64S相近。玉兔S的特殊配合力并不因其带有白化转绿型叶色标记而下降。2.3白化转绿型原理的确定遗传研究表明,与原亲本培矮64S正反交及与恢复系9311杂交,所有杂种F1均表现为正常绿色,数据由中国水稻研究所提供。DatawereprovidedbyChinaNationalRiceResearchInstitute.数据由浙江省农业科学院植物保护研究所提供。DatawereprovidedbyPlantProtectionInstitute,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences.表明玉兔S的白化标记为隐性性状。F2分离群体调查表明,3个杂交组合玉兔S/培矮64S、培矮64S/玉兔S、玉兔S/9311中绿色株与白化株的比例分别为3.12∶1、2.98∶1和3.04∶1,符合3∶1分离比(表4)。对F3跟踪观察表明,上代所有白化株的白化性状已稳定纯合,未出现叶色分离,绿色株中2/3左右的株系后代分离出现白化苗。上述结果说明,白化转绿型叶色突变性状受单隐性基因的控制。利用325个SSR标记将白化转绿型叶色突变基因gra(green-revertiblealbino)定位在第10染色体上,其中标记RM590与其紧密连锁(图6)。3带有色标记的杂交稻种质鉴定带叶色标记杂交水稻不育系的应用并不仅仅局限于杂种的去杂保纯,更为有意义的是它为简便、经济地鉴定杂种纯度提供了一个强有力的技术手段。现行的杂种纯度的鉴定方法主要有异地种植法、同工酶法和DNA分子标记法3种。异地种植法为一直沿用的常用方法,准确性较高,但鉴定时间长,费财、费力且结果滞后于销售行为。同工酶法具快速、准确、分辨率高等优点,但它存在许多不足之处,如同工酶的提取、电泳所需条件严格且易失活等。DNA分子标记法则存在设备精度要求高、操作技术复杂和成本高等缺陷。为此,不少学者提出了以叶色标记为识别手段进行杂种纯度鉴定的设想[6,9,10,11,12,13,14,17]。现有带叶色标记的不育系仍存在叶色标记全生育期表达,从而不同程度影响不育系本身的农艺性状及繁、制种产量问题。舒庆尧等采用核技术为主,结合杂交和回交育种技术,选育了携带叶缘白化转绿型叶色标记的三系不育系全龙A。但有关携带转绿型叶色标记的实用型两系不育系研究尚未见报道。本研究选育的玉兔S携带的白化标记为生长发育特异性表达型标记,其第1~3幼叶白化,极易与杂种F1正常绿色幼苗相区别,从而为杂种纯度的快速鉴定提供了基础。在一般情况下,两系杂交稻制种中混杂的杂株大多数源于育性回复的不育系。因此,以白化转绿型叶色标记为识别手段,只要通过常规的发芽试验就可快速、准确估算不育系中串粉种子的比例