2种有毒亚历山大藻的生物毒性研究

2种有毒亚历山大藻的生物毒性研究

麻痹性苦贝（psp）是一种由有毒甲藻（stx）和其衍生物组成的毒素总称。这是对人类生命和健康的威胁，也是已知的最常见的海海藻毒素。据统计,在全球范围内每年报道PSP引起人类中毒事件约有2000起,其中死亡率15%。我国已发生多起疑为PSP引起的中毒事件,主要发生在南方的福建、广东、香港和台湾沿海地区。甲藻中的亚历山大藻属是重要且分布广泛的PSP产毒藻,各种亚历山大藻的产毒能力和毒素组成皆不同。在我国,塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)被疑为是多起PSP事件的毒素生产藻,已从沉积物孢囊萌发和海水中营养细胞分离得到了塔玛亚历山大藻并在实验室培养成功,于仁诚等对其产毒过程进行了较全面的研究。微小亚历山大藻在我国台湾沿海较常见且引起当地海域多起PSP事件的发生,本文对微小亚历山大藻的不同阶段的产毒状况及毒素组成进行研究,同时与太平洋东岸的一株亚历山大藻(Alexandriumsp.)进行了比较。1材料和方法1.1藻细胞样品的制备微小亚历山大藻AMTK-Ⅰ引自台湾大学。该藻使用f/2-Si培养液(不含Si的f/2培养液)培养,培养液所用过滤海水先以去离子水稀释一倍,使盐度为15~17。培养温度为(24±0.5)℃,光强70μE·m-2·s-1左右,光暗周期比12L∶12D。实验所用海水、培养液、过滤容器及培养容器均预先经高压蒸气灭菌。实验接种时采用对数生长后期的微小亚历山大藻,接种密度约为400个/mL,培养于3L玻璃锥形瓶内,培养液约2L。藻类取样在接种后的第4,7,10,12,14,16和19天进行,取样时间约在当日15∶00。取样前轻轻摇动培养瓶,将藻细胞混匀,根据藻浓度每次取样400~50mL(约含7×105个藻细胞)。其中3mL加碘液固定,然后在倒置显微镜下用0.5mL浮游植物计数框计数3次,计算平均藻细胞浓度。其余样品进行毒素提取,以3000r/min离心10min,小心吸掉离心管中的上清液至沉淀细胞表面上方约1cm,继续离心5min,吸掉上清液,藻细胞以5mL0.05mol/L的乙酸溶液重新悬浮,然后将离心管置冰浴中超声破碎1min,以打碎藻细胞。取部分藻液在显微镜下观察确定细胞已完全破碎。再次以13000r/min离心10min,取上清液用0.45μm滤膜过滤,滤液置于-20℃冰箱中保存直至分析。1.2藻细胞的培养与测定对阿拉斯加亚历山大藻KW06的实验在美国食品与药物管理局(FDA)海洋食品毒素实验室进行,该藻原从阿拉斯加海域沉积物孢囊中萌发分离得到。藻类培养采用f/2-Si培养液,培养液经预先高压蒸气灭菌;海水采用过滤的自然海水(盐度约为32),实验前再用0.22μm孔径滤膜过滤以去除细菌;藻液培养于500L玻璃缸内;培养温度8℃,通过24h循环水控制温度;24h进行充气;光照约80μE·m-2·s-1,光暗周期比为16L∶8D。接种时采用对数生长期藻细胞,接种浓度约为200个/mL。藻类的取样在接种后第4,8,12,14,18,21,24,26天进行。考虑到培养体积较大,培养缸表底层藻细胞有可能存在的生理差异,所以采样时从培养缸的表层和底层分别混匀后取样,体积约为250mL。用扁毛细管吸取部分藻样,在倒置显微镜下直接计数活体藻细胞,每样品计平行样3次,计算平均藻细胞浓度。其余的藻液定体积后用于毒素的提取,方法同微小亚历山大藻。1.3加热水解所有的毒素分析按照Oshima建立的PSP高效液相色谱分析方法进行,其中N-磺酰氨甲酰基类毒素的检测通过酸性条件下90℃加热水解15min,同一样品在水解前后各分析2次,通过水解前后的GTX,STX,neoSTX的浓度变化,来计算C毒素和B毒素,其中C1,C2,C3分别通过GTX2,GTX3,GTX1的增加来计算,B1,B2分别通过STX,neoSTX的增加来求得。分析得到的各毒素含量,根据每一毒素的毒性值换算出毒性大小。2结果2.1单位细胞毒素与培养时间批次培养微小亚历山大藻AMTK-I的生长曲线见图1(a)。在本试验设定的生长条件下,其生长率达到0.3~0.4Div/d。对该藻的毒素分析结果表明,与以往PSP产毒藻研究结果[2,8,9,10,11,12,13,14,15]类似,单位细胞毒性在对数生长初期最高,培养第4天细胞毒素含量达31.4fmol,为最高值,之后随培养时间的延长而逐渐降低,见图1(b);下降过程中速度先快后慢,至培养第19天只有10.2fmol,而培养液中的毒素浓度随培养时间的增加而升高,见图1(c)。其上升趋势与毒藻的生长曲线相一致,在培养后期总浓度达最高。阿拉斯加亚历山大藻KW06的产毒与培养阶段的关系与微小亚历山大藻类似,单位细胞毒素含量与培养时间呈负相关。由于该藻接种浓度较低,故在毒藻生长延迟期取样毒素含量较低,而培养第7天毒素含量最高。从培养缸表层和底层分别所取的藻细胞在毒素含量大小及趋势上都没有明显差异(图2)。2.2藻体毒素组成微小亚历山大藻AMTK-I所产生的毒素有GTX4,GTX1,GTX3和GTX2。C毒素,STX,neoSTX和dc类毒素没有检出,尽管总毒素含量随时间变化很大,但毒素组成在藻生长周期内相对稳定。然而值得指出的是,总毒素中占有较大比例的GTX1,GTX4从指数生长末期至静止期内有增高的趋势,而占比例较小的GTX2,GTX3却在相应阶段有逐渐下降的趋势(图1d)。该藻毒素含量不高,毒性为9.3pgSTXeq/个。亚历山大藻KW06只检测到含量高的STX和微量的neoSTX,其毒性达到19.6pgSTXeq/个。3浮液和毒素组成PSP产毒藻在一次性培养中毒素产生情况的研究实验结果[7,8,9,10,11,12,13,14,15,16]都证明,细胞的毒素含量变化与生长趋势相反,即对数生长早期细胞毒素含量最高,中后期逐渐下降,到静止期降至最低。其中对亚历山大藻研究得最多,另外Usup对巴哈马火甲藻扁形变种Pyrodiniumpressum的同类研究中,也得出了类似的结论。Anderson认为细胞毒素含量的高低是毒素合成引起的含量增高与其降解代谢、自然排除及细胞分裂所造成的含量减少之间平衡的结果,毒藻生长期内毒素水平的变化反映了毒藻生理状态的变化。另一种说法认为毒素浓度前后的不同是一次性培养过程中前后期营养的不均衡所致,当细胞刚被转移至营养盐丰富的新鲜培养液中时可能产生一时的氮过剩,在这段时间对氮的吸收超过了提供蛋白质合成的碳,从而造成细胞内自由氨基酸库中的谷氨酸的积累以及其他氨基酸积累的可能。又因为富氮的精氨酸被认为是PSP毒素的重要前体物质,所以对数生长早期毒素量的升高可能是过剩的精氨酸转移至毒素的结果,而随后细胞内成分的合成利用了大量的氮,毒素的合成也相应下降。不同亚历山大藻的毒素组成和毒性大小有很大差别。总的来说,塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻多含有高比例的C毒素,GTX1~4也占有相当比例,STX和neoSTX含量很少或检不出。微小亚历山大藻通常只含有GTX毒素,C毒素和STX较少见。本实验所选用微小亚历山大藻AMTK-Ⅰ毒素分析结果基本符合该种藻的毒素组成特征,另一株太平洋东岸的Alexandriumsp.KW06则只含有较高浓度的STX和微量neoSTX,很难根据毒素特征判断其所属种类。另外也有实验证明同种藻采自不同海域,毒素组成和各毒素所占比例也有差别,含量差别更大。于仁诚曾用改良的Thielert液相色谱法对分别采于我国广东大亚湾和香港地区的2株产毒塔玛亚历山大藻进行实验比较,结果发现两者无论毒素组成还是含量均有较大差别。而Anderson曾用Oshima方法对3株同是从广东大鹏湾分离的塔玛亚历山大藻ATCI01-03进行了毒素分析,则发现其毒素组成和含量相似。有研究认为毒藻内毒素组成是相对稳定的,而Boczar和Boyer对塔玛亚历山大藻的研究表明,其毒素组成比可随培养时间变化,主要表现为在细胞总毒素量开始下降时,GTX1和GTX4的相对含量(在总毒素量中所占的比例)反而升高,同时GTX2,3降低。本实验结果证明,在毒藻的生长周期中,不但毒素的含量会发生变化,其各毒素的组成比也并非一成不变,它随着生长条件和生理状态的改变可发生缓慢的变化。在本实验中发现微小亚历山大藻从对数生长后期到静止期GTX1,4比例增高而GTX2,3降低。最近有研究表明,塔玛亚历山大藻的细胞提取物可