发酵工艺学课件：第九章 发酵生产实例1

第九章发酵生产实例第一节抗生素发酵生产技术1.概述抗生素是微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物的生命活动。SirAlexanderFlemingdiscoveredtheantibioticpenicillin.Hehadtheinsighttorecognizethesignificanceoftheinhibitionofbacterialgrowthinthevicinityofafungalcontaminantwhenmostotherscientistsprobablywouldhavesimplydiscardedthecontaminatedplates.AlexanderFleming(1881-1955)青霉素的发现者及1945年诺贝尔生理学医学奖获得者AlexanderFleming(1881-1955)ErnstB.

Chain(1906-1979)HowardW.

Florey(1898-1968)SelmanA.Waksman(1888-1973)——获1952年诺贝尔医学和生理学奖1942年Waksman从放线菌中分离出了链霉素根据抗生素的作用机制分类抑制细胞壁合成：青霉素抑制细胞膜功能：多肽类抗生素抑制蛋白质合成：四环素抑制核酸合成：丝裂霉素

分类Classification复制翻译转录根据抗生素的化学结构分类β-内酰胺类：青霉素类(penicillins)

头孢菌素类(cephalosporins)氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素大环内酯类：红霉素、麦迪霉素四环类：四环素、土霉素多肽类：多粘菌素类亚类主要品种b-内酰胺类(b-Lactams)青霉烷类头孢烯类氧头孢烯类碳头孢烯类青霉烯类碳青霉烯类单环内酰胺类

-内酰胺酶抑制剂青霉素G，青霉素V，氨苄西林，阿莫西林，······头孢噻吩，头孢唑啉，头孢氨苄，头孢羟氨苄，······拉氧头孢，氟氧头孢氯碳头孢瑞替配能，法罗配能亚胺配能，帕尼配能，美洛配能，比阿配能氨曲喃，卡鲁莫喃棒酸，舒巴坦，三唑巴坦，舒他西林，三唑配能类亚类主要品种氨基糖苷类(Amino-glycosides)天然半合成链霉素，卡那霉素，庆大米星(庆大霉素)，小诺米星(小诺霉素)，核糖霉素，妥布霉素，紫苏霉素，阿斯米星(福提霉素)，大观霉素，新霉素，春日霉素，有效霉素半合成卡那霉素：阿贝卡星，阿米卡星，地贝卡星；半合成紫苏霉素：奈替米星；半合成庆大霉素：衣替米星类亚类主要品种大环内酯类(Macro-lactones)14员环15员环16员环>20员红霉素，竹桃霉素，半合成红霉素克拉霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉素阿齐霉素(半合成红霉素)柱晶白霉素(北里霉素)，交沙霉素，麦迪霉素，罗他霉素(丙酰柱晶白霉素)，乙酰螺旋霉素和丙酰螺旋霉素(半合成螺旋霉素)，三冈霉素(半合成麦迪霉素)，泰洛菌素，除虫菌素，双氢除虫菌素(半合成除虫菌素)，环氧噻酮藤霉素(他克莫司)，雷帕霉素(昔洛莫司)

HNONSCH3CH3HCOO-H青霉素母核：6-氨基青霉烷酸(6-APA)R头孢菌素母核：7-氨基头孢烷酸（7-ACA）阿莫西林Amoxicillin又名羟氨苄青霉素主要的抗药机制产生修饰抗生素的酶：修饰b-内酰胺抗生素的b-内酰胺酶，修饰氨基糖苷抗生素的乙酰化酶、磷酸化酶和腺苷化酶。修饰自身的药物作用靶：改变青霉素结合蛋白，降低细胞壁前体对万古霉素的亲和性。减少药物的摄入或强化药物的排出：降低细胞膜的通透性而对氨基糖苷及碳青霉烯抗生素耐药，增强药物排出泵的活力而对四环素类、大环内酯类及喹诺酮类抗生素耐药。病原菌对抗生素产生的抗药性当青霉素进入到某些细菌体内的时候，不仅和青霉素结合蛋白亲密接触，还会触动细菌体内埋伏的某种基因机关。一些特定的蛋白和青霉素结合之后，一段基因编码将启动细菌的加工系统。大量具有特殊功能的蛋白质被迅速合成。这些蛋白质贯穿细胞膜，消耗能量，捕获细胞内的青霉素，然后将其驱逐到细胞之外。抗药性的预防开发新抗生素及对已有抗生素进行结构改造；用抑制耐药机制的药物与抗生素组成复方；开发预防病原菌感染的疫苗；改善环境卫生，加强医院病原体及废弃物的无害化管理，阻断病原菌传播；对症用药，除恶务尽，不滥用抗生素。产生菌的育种、筛选抗菌性试验提取、精制、鉴定毒性试验药理和临床试验

2．生产前期研究ResearchinLab

Agardiffusionassayagarplate琼脂培养基lawnoftestbacteria测试菌苔filterpaperssoakedwithtestcompounds含药物滤纸zonesofinhibition(nogrowth)

抑菌圈人工诱变法：紫外线、X-线、γ-线照射亚硝基胍、亚硝酸、秋水仙素、氮芥等诱变剂处理3.抗生素生产菌改良StrainImprovement基因工程GeneticEngineering

3.抗生素生产菌改良StrainImprovementRecombinantDNATechnology（DNA重组技术）克隆青霉素菌种改良Fleming—点青霉,适用固体发酵2U/ml1943,美国甜瓜分离的产黄青霉利于液体发酵120U/ml—诱变—Wisconsis菌株WisQ176

900U/ml—Wis.B13-D10无色素诱变，提高产量，目前已超过80,000U/ml。StrainImprovementScale-up出发菌株平板技术摇瓶培养二级摇瓶培养各种培养基

小型发酵罐模拟生产条件MastercellbankWorkingcellbank菌种扩大培养中试生产生产3003031Possiblerecycle摇瓶发酵装液量：10%(~250ml)间歇培养温控受限制代谢碳水化合物慢缓冲液控制pH在线取样难容量减少瓶壁上结垢无需消泡搅拌受限制无法控制溶解氧10-100,000升容量补料培养连续控制：pH，温度需要铵盐或氨气无需缓冲液在线取样易补料,容量增加生长均匀一致需消泡搅拌控制溶解氧:通气,加压搅拌罐发酵→种子制备

→发酵

→发酵液预处理→提取及精制→成品包装4.抗生素生产工艺过程Aschemeofthematerialflowinanantibioticproduction发酵罐缓冲罐种子罐发酵生产原料

碳源:乳糖、蔗糖、葡萄糖甜菜和甘蔗糖蜜淀粉乙醇，甲醇甘油麦芽糖浆，玉米糖浆绵籽油，花生油，豆油猪油油酸甲酯油脂氮源:玉米浆、绵籽粉大豆粉花生粉菜籽粉牛血，酪蛋白水解液乳清鱼粉酵母酵母膏肉粉和骨粉

发酵生产原料发酵控制

SampleAnalysisDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationpHPressureprobeLevelprobepHprobeTemp.probeDOprobeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/Oilfeed青霉素生产菌种——产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)的分生孢子4.1青霉素生产工艺过程

培养基ComponentsRange%组成Glucose/sucrose3.0-5.0葡萄糖/蔗糖Starch淀粉3.0-5.0玉米浸提液

3.0-5.0碳酸钙0.5-1.0Phosphate磷酸盐0.1-0.5Ammoniumsulphate0.1-1.0

硫酸铵Urea尿素0.1-0.5Oil油0.1-0.5发酵培养基

ComponentsRange%组成Glucose葡萄糖0.5-1.0Starch淀粉0.5-5.0玉米浸提液5.0-8.0

豆饼粉1.0-5.0Phosphate0.1-1.0Ammoniumsulphate0.5-1.0andfedperiodicallyOil1.0andfedcontinuously种子培养基ScaleWeightSignalPumpSpeedAmplifierControllerSupervisoryComputer

FlowRateControl流量控制发酵控制Fermentationcontrol青霉素的生产菌种(strain)：产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)孢子培养(sporecultivation)：25ºC,6-7d种子培养(seedcultivation)：25ºC，2-3d发酵培养(fermentation)：22-26ºC,6-7d加糖控制(sugarfeeding)：残糖降至0.6％

青霉素发酵总体流程补氮(nitrogenfeeding)：氨控制在0.01-0.05％,补

硫酸铵、氨水或尿素。前体(precursor)：残余苯乙酰胺0.05-0.08％温度控制(temperature)：前期25-26ºC(菌丝生长)后期23ºC(分泌青霉素)通气与搅拌(aeration&stir)：1:0.8VVM泡沫(foam)：天然油脂,如豆油控制铁离子浓度，小于30µg/ml分离：过滤—醋酸丁酯萃取、脱色—过滤—结晶青霉素发酵总体流程发酵中不加侧链前体时，产生多种N-酰基取代的青霉素，青霉素G、青霉素X、青霉素F、青霉素K、青霉素V等。青霉素G、青霉素V有临床给药价值，青霉素V可口服。HNONSCH3CH3HCOO-H青霉素母核：6-氨基青霉烷酸(6-APA)RPenicillinFermentationProfile变化曲线4.2头孢菌素C的生产生产菌种：枝顶头孢（Cephalosporiumacremonium），又称产黄枝顶孢。生产流程：枝顶头孢→斜面培养→摇瓶培养种子罐→发酵→过滤→超滤→结晶→过滤干燥→头孢菌素锌盐工艺控制点：氨氮：0.5~0.7g/L；pH：~6.5。原料消耗：10~20氨30~120糖17~23无机盐70~130豆油50~75玉米浆80~160氧消耗量(kg/m3发酵液)物质名称消耗量(kg/m3发酵液)物质名称Cephalosporiumacremonium的气生菌丝4.3棒酸的工业生产生产菌种：带小棒链霉菌（Streptomycesclavuligerus）生产流程：带小棒链霉菌孢子→斜面培养→摇瓶培养→种子罐培养→发酵

→冷却→过滤→离子交换→萃取→结晶→重结晶→成盐→棒酸钾沉没培养的链霉菌(Streptomyces)菌丝4.4红霉素的发酵生产产生菌：红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)菌种选育：表达透明颤菌(Vitreoscillasp.)血红蛋白(VHB)基因工程菌可减少氧的需要，提高产量。发酵培养基：碳源——淀粉，蔗糖，葡萄糖，植物油；氮源——豆饼粉，花生饼粉，棉籽饼粉，硫酸铵；前体——丙酸或丙醇；无机盐——磷酸盐，硫酸镁等。发酵过程控制：碳/氮比、磷酸根和氨氮浓度；前体——通过流加方法控制。红霉素的提取：发酵液→调pH→醋酸丁酯萃取→结晶→干燥5.天然抗生素的改造抗耐药菌、降低毒性、提高疗效青霉素的改造：过敏、不易口服、耐药保留母核(6-APA)对R基团改造苄青霉素为原料，以青霉素酰化酶进行裂解后制取6-APA。将6-APA与化学合成侧链进行酶法催化，得到半合成青霉素。

HNONSCH3CH3HCOO-H青霉素母核：6-氨基青霉烷酸(6-APA)R头孢菌素母核：7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的生产

D-氨基酸氧化酶（Trigonopsisvariabilis,Fusariumsolani）

脱羧

GL-7-ACA酰胺酶（Pseudomonassp.)头孢菌素Ca-酮己二酰-7-氨基头孢烯酸

戊二酰-7-氨基头孢烷酸

(GL-7-ACA)7-ACA几种半合成b-内酰胺抗生素的酶法合成苯甘氨酸甲酯6-APA转酰基酶转酰基酶转酰基酶苯乙醇酸甲酯

苯甘氨酸甲酯7-ADCA7-TACA

氨苄西林

头孢氨苄

头孢羟唑

+++课堂汇报及讨论开发、设计一种微生物工程产品3-6人为一小组，查阅资料说明项目的市场需求及国内外现状投资、产值、可行性、需要设备及条件生产的主要技术流程、废弃物处理等情况每位同学都能够回答其他同学的提问小组成绩为每位同学的成绩，计入平时成绩将相关材料及PPT发到我邮箱yhyi1@一、b-内酰胺抗生素的分类青霉烷(penams)青霉烯(penems)碳青霉烯(carbapenems)头孢烯(cephems)碳头孢烯

氧头孢烯

单环

-内酰胺

氧青霉烷

(棒烷)青霉烷砜(carbacephems)(oxocephems)(monobactams)(oxopenams)(penicillanicacidsulfone)第三章b-内酰胺抗生素

第四节青霉素的工业生产青霉素发酵过程主要变量的典型变化曲线第三章b-内酰胺抗生素

第四节青霉素的工业生产

青霉素生产工艺要点（一）

生产菌种的长期保存要采用孢子悬浮液液氮低温（-196℃）存放或真空冷冻干燥管冷藏（4℃）的方法，而不采用传统的沙土管保藏方法，以便在较长时间（5~10年）内保持菌种的存活和生产能力稳定。琼脂斜面种子（孢子）密封后在4~15℃下可以短时间保存，但最好不要超过3个月。米孢子的基质可以是大米或小米，培养成熟后密封可以在4~15℃下保存不超过3个月；如果在密封前真空干燥，则可以保存不超过6个月。种子罐以达到对数生长的后期为培养成熟指标，不能随意延长或缩短培养时间；同时要考虑培养液的流动性，以不影响通过管道向发酵罐接种的速度为宜。第三章b-内酰胺抗生素

第四节青霉素的工业生产

青霉素生产工艺要点（二）发酵罐的发酵条件要严格按工艺要求进行控制，特别是各项补料要适应工艺对溶氧、pH及维持量的要求，不能过量，也不能不足；为了减少过程空气湿度对发酵液体积的影响，在湿度偏高或偏低的季节，要适当提高或降低用于补料的糖液浓度。氨水既作为发酵的氮源，又用来调节发酵过程中的pH，它的补入要根据发酵液的pH和铵氮含量与补硫酸铵协调进行。发酵液过滤要尽量提高速度，缩短时间，为此一般需要在过滤前对发酵液进行絮凝处理，絮凝剂的加入量随絮凝剂种类不同而异，以达到最大絮凝效果而不过量为宜。除种子制备和发酵过程要严防杂菌侵入外，提取的各工序也应尽量保持无菌，因为污染细菌极有可能产生能破坏青霉素的青霉素酶；特别是过滤，由于操作时间长，料液营养丰富，容易滋生杂菌，故必须定期对设备和过滤介质进行清洗和灭菌，必要时可在过滤前加入4‰福尔马林防腐。第三章b-内酰胺抗生素

第四节青霉素的工业生产

青霉素生产工艺要点（三）青霉素对热、酸、碱都不稳定，而萃取操作正好处于不稳定pH范围内，故萃取过程要尽量降低温度，缩短时间，以减少青霉素的降解；离心萃取速度快，青霉素在不稳定pH下维持时间短，是