第5章 酶学课件

Enzyme第5章酶学第一节酶促反应的特点及酶的分类第5章酶学酶的发现及研究历史人们对酶的认识起源于生产与生活实践。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。酶者，酒母也第5章酶学第5章酶学enzyme("inyeast")enzyme是希腊文en=in，zyme=yeast第5章酶学什么是酶？酶是生物催化剂生物体一切生化反应都需酶催化才能进行！性能远远超过人造催化剂定义：由活细胞产生的、有高度专一性和 高效催化作用的生物大分子。第5章酶学酶及生物催化剂概念的发展……克隆酶、遗传修饰酶蛋白质工程新酶生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：

Enzyme(天然酶、生物工程酶)核酸类：Ribozyme;Deoxyribozyme模拟生物催化剂第5章酶学一、酶的催化特性1.提高反应速度，不改变平衡点;2.只起催化作用，本身不消耗；

3.降低反应的活化能。（一）与一般催化剂相同的特点第5章酶学

活化能(activationenergy)

指在一定温度下，1mol底物全部进入活化态所需要的自由能单位：KJ/mol酶催化反应的实质：降低反应的活化能第5章酶学1.

易失活（温和性）（二）生物催化剂的特点常温、常压、中性

除个别RNA为催化自身反应的酶外，其余所有的酶都是蛋白质。第5章酶学2.高效性且无副反应反应速度是无酶催化/普通人造催化剂催化反应速度的106——1016倍。第5章酶学

酶的催化双氧水裂解第5章酶学3.专一性Specificity:酶对催化的反应和反应物有 严格的选择性。底物（Substrate):

酶作用的物质。第5章酶学

（1）酶浓度的可调性（2）通过激素调节酶活性（3）反馈抑制调节酶活性（4）抑制剂和激活剂（5）别构调控、共价修饰、同工酶等4.可调节性第5章酶学—指酶对底物的选择性，也称特异性。反应专一性立体异构专一性绝对专一性相对专一性族专一性键专一性旋光异构专一性几何异构专一性二、酶的专一性第5章酶学三、酶的命名和分类（一）习惯命名法根据其催化底物来命名,如淀粉酶、蛋白酶等；根据所催化反应的性质来命名,如脱氢酶、转移酶等；结合上述两个原则来命名，例如丙酮酸脱羧酶等。有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。第5章酶学优点

命名简单应用历史较长，使用方便缺点

一名数酶、一酶数名为了适应酶学发展的新情况，国际酶学会议于1961年提出一个新的系统命名法及分类原则，已被国际生化协会采用。第5章酶学（二）国际系统命名法：系统名称包括底物名称、反应性质，最后加一个酶字。第5章酶学

底物1：底物2+反应性质+酶

乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化还原酶当底物为水时，可省略第5章酶学

系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化还原酶

惯用名：只取较重要的底物名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。第5章酶学（三）国际系统分类编号1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：第5章酶学第5章酶学氧化-还原酶催化氧化-还原反应，催化氢的转移或电子传递。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。1、氧化还原酶

OxidoreductaseAH2+B（O2）A+BH2（H2O2，H2O）（四）六大类酶的特征第5章酶学（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应AH2+BA+BH2（需辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ）（2）氧化酶类①催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2+O2A+H2O2（需FAD或FMN）②催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2+O22A+2H2O（3）过氧化物酶ROO+H2O2RO+H2O+O2第5章酶学（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2+OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺-已二烯二酸）RH+O2+还原型辅助因子ROH+H2O+氧化型辅助因子（又称羟化酶）第5章酶学转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。根据X分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。2、转移酶

TransferaseA·X+BA+B·X第5章酶学水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：3、水解酶

hydrolaseAB+H2OAOH+BH第5章酶学裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。4、裂合酶

Lyase第5章酶学异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。

例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应5、异构酶

IsomeraseABPP第5章酶学合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2

草酰乙酸6、合成酶

LigaseorSynthetaseA+B+ATPA·B+ADP+Pi第5章酶学酶的系统编号：4位数字第一位：代表六大类反应类型第二位：亚类（作用的基团或键的特点）第三位：亚亚类（精确表示底物/产物的性质）第四位：在亚亚类中的序号乳酸脱氢酶

EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的编号第5章酶学第二节酶的结构与功能的关系第5章酶学一、酶的化学本质及分类①经酸碱水解终产物是AA②能被蛋白酶水解而失活③酶可变性失活④酶是两性电解质⑤具有不能通过半透膜等胶体性质⑥具有蛋白质的化学呈色反应化学本质是蛋白质（一）酶的化学本质第5章酶学1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后又陆续发现了真正的RNA催化剂。第5章酶学

单纯酶：只有蛋白质结合酶（缀合酶）：脱辅酶+辅助因子辅助因子辅基辅酶{与酶结合紧与酶结合松全酶（二）酶的化学组成第5章酶学羧肽酶第5章酶学NADPH—脱氢酶的辅酶过氧化氢酶第5章酶学结合酶中：单独酶蛋白或辅助因子没有催化活性一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合同种辅助因子可与不同的酶蛋白结合

第5章酶学酶蛋白：决定反应的专一性辅助因子：传递电子、原子或某些 化学基团的作用第5章酶学第5章酶学monomericenzyme：一般由一条肽链组成oligomericenzyme：为寡聚蛋白，≥2个亚基multienzymecomplex：几种酶靠非共价键 彼此嵌合而成。由数个独立的酶组合起来形成络合体，催化一系列反应。（如糖代谢、脂代谢）（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体根据酶蛋白分子的特点：第5章酶学活性中心（activecenter)——与酶活力直接相关的区域局限在酶分子的特定部位二、酶的活性部位(activesite）第5章酶学

结合中心：与底物结合决定酶促反应的专一性

催化中心：促进底物发生化学变化决定酶促反应的性质

活性中心第5章酶学——与酶的催化活性直接相关的化学基团常见：His咪唑基、Ser-OH、

Gluγ-COOH、Cys-SH、Asp-OH位于活性中心活性中心以外，稳定分子构象必需基团非必需基团（一）必需基团第5章酶学底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心第5章酶学AspHisSer胰凝乳蛋白酶的活性中心活性中心重要基团:His57,Asp102,Ser195第5章酶学为Tyr248为Arg145为Glu270为底物Zn羧肽酶活性中心示意图

第5章酶学（二）酶活性部位的特点1、几个残基+辅助因子（单纯/结合）2、在空间构象上集中到一起（单体/寡聚）3、疏水空穴4、通过次级键与底物结合6、活性中心构象具有柔韧性和可塑性5、与底物诱导契合第5章酶学

酶AA残基活性中心AA核糖核酸酶124HHKRDE溶菌酶129DE胰凝乳蛋白酶241HDS羧肽酶A307REYZn2+胰蛋白酶223HDS第5章酶学三、研究酶活性部位的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰法

化合物活性部位AA残基侧链基团↓

共价结合水解酶，确定一级结构位置第5章酶学

——推测某基团是否在活性中心某基团被修饰后：

酶活力改变：为必需基团（1）非特异性共价修饰第5章酶学（2）特异性共价修饰——试剂专一修饰活性部位某AA，使酶失活。

如：二异丙基氟磷酸（DFP)专一修饰ESer-OH仅修饰活性中心Ser-OH第5章酶学第5章酶学(3)亲和标记法——与S结构相似的共价修饰剂能被专一地引入活性部位，接近S结合位点其活泼的化学基团可与活性部位某一基团形成稳定的共价键第5章酶学对甲苯磺酰－L－苯丙氨酸乙酯(TPE)对甲苯磺酰－L－苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶第5章酶学2.动力学参数测定法

活性部位AA残基解离状态和酶活性直接相关

通过动力学方法求有关参数，对酶活性部位化学性质作出判断。3.X射线晶体结构分析法

第5章酶学4.定点诱变法

利用定点诱变技术，改变编码蛋白基因中的DNA顺序，改变其中某AA后，测定酶活性的变化。第5章酶学四、酶原的激活

酶原(zymogen)：酶的无活性的前体

酶原的激活：由无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。

酶原激活的意义：在特定的环境和条件下发挥作用；避免细胞自身消化；有的酶原可以视为酶的储存形式。第5章酶学

酶原激活的机理:酶原分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心

一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下第5章酶学赖缬天天天天甘异赖缬天天天天缬组丝SSSS46183甘异缬组丝SSSS肠激酶胰蛋白酶原活性中心胰蛋白酶原的激活过程胰蛋白酶第5章酶学胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽+弹性蛋白酶原弹性蛋白酶+碎片胰凝乳蛋白酶原α-胰凝乳蛋白酶+二肽羧基肽酶原A羧基肽酶A+碎片肠激酶自身催化肠激酶启动的酶原激活第5章酶学第5章酶学第5章酶学

第三节酶作用的机制

第5章酶学诱导契合机制

酶与底物靠近

定向

酶与底物相互诱导变形

契合成中间产物

产物脱离一、酶催化高效性的机制酶催化的本质：降低反应的活化能。第5章酶学一般催化剂反应活化能反应总能量变化酶促反应活化能非催化反应活化能初态终态能量改变活化过程酶促反应降低活化能过渡态第5章酶学（一）底物和酶的邻近效应和定向效应

靠近静电吸引疏水作用定向底物酶第5章酶学（二）底物的形变和诱导契合诱导互补性结构变化契合能否契合—专一性的由来第5章酶学产物脱离酶复原－催化剂第5章酶学羧肽酶A第5章酶学＋羧肽酶催化中的电子云形变

第5章酶学

C＋=O－靠近电子云形变

定向极性专一性契合区H2+N＝C精氨酸C端确认区注意＋第5章酶学酶活性中心提供H+/H+受体使敏感键断裂的机制。酸催化(－OH、－NH3+、＝NH+、-COOH、－SH)A-:H+EHE-H2OEH+OH-+H+AH+B+碱催化(失电子态)A-:B++E-COO-A-+E-COOH

E-COO-+H+（三）酸碱催化第5章酶学第5章酶学碱催化＋酸催化第5章酶学稳定活性中心吸附羧氧原子使肽键失稳第5章酶学——酶活性中心亲电/亲核基团参与S敏感键断裂的机制。亲电基团——带正电荷性质的基团亲核基团——带负电荷性质的基团（四）共价催化第5章酶学A-:B+¨+-OH-NH2咪唑基亲电催化2A-:2B++

Mg2+A:Mg¨A

+2B+亲核催化¨-OH¨-SHA-:

+HO:B中间产物不稳定，断裂，形成产物，酶复原。（不同酶促反应中的催化因素影响大小不同。）¨第5章酶学＋第5章酶学－OH的亲核催化(胰凝乳蛋白酶)第5章酶学1、需要金属离子的酶（1）金属酶(metalloenzyme)含紧密结合的金属离子（2）金属激活酶(metal-activitedenzyme)含松散结合的金属离子（五）金属离子催化第5章酶学2、金属离子的作用

A、参与底物反应的定向

B、通过价态改变参与电子转移

C、通过静电稳定/屏蔽负电荷第5章酶学（1）锁钥学说——刚性构象（2）诱导契合学说（3）结构性质互补学说

——静电效应、极性相同（4）三点附着学说

——立体异构专一性的酶二、与酶专一性有关的学说第5章酶学锁钥学说认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样第5章酶学诱导契合学说酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.

（Koshland，1958）：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。第5章酶学羧肽酶的诱导契合模式第5章酶学结构性质互补学说结合的专一性，与底物结构和酶活性中心的空间结构相关，二者的结构互补第5章酶学“三点结合”的催化理论酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。第5章酶学第5章酶学第四节酶促反应的动力学第5章酶学3.4酶促反应动力学

酶促反应动力学(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。酶促反应的影响因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。酶促反应动力学第5章酶学一.酶浓度的影响在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大于100Km时，速度与酶的浓度呈正比。酶浓度对速度的影响机理：酶浓度增加，[ES]也增加，而V=k3[ES]，故反应速度增加。第5章酶学二.温度对酶促反应速度的影响

酶促反应与其它化学反应一样，随温度的增加，反应速度加快。化学反应中温度每增加10℃反应速度增加的倍数称为温度系数Q10。一般的化学反应的Q10为2～3，而酶促反应的Q10为1～2。

在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度（optimumtemperatureTm）.一般动物组织中的酶其最适温度为35～40℃，植物与微生物中的酶其最适温度为30～60℃，少数酶可达60℃以上，如细菌淀粉水解酶的最适温度90℃以上。第5章酶学

温度对酶促反应速度的影响机理：1.温度影响反应体系中的活化分子数：温度增加，活化分子数增加，反应速度增加。2.温度影响酶的活性：过高的温度使酶变性失活，反应速度下降。

最适温度不是酶的特征常数，因为一种酶的最适温度不是一成不变的，它要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂、酶反应时间等因素的影响。因此，酶的最适温度与其它反应条件有关。第5章酶学第5章酶学三.pH对酶促反应速度的影响

大多数酶的活性受pH影响显著，在某一pH下表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力显著下降。酶表现最大活力的pH称为酶的最适pH。典型的酶速度-pH曲线是较窄的钟罩型曲线，但有的酶的速度-pH曲线并非一定呈钟罩型。如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度-pH曲线。胃蛋白酶的速度-温度曲线如下图：第5章酶学胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲线：第5章酶学第5章酶学pH对酶促反应速度的影响机理：1、pH影响酶和底物的解离:

酶的活性基团的解离受pH影响，底物有的也能解离，其解离状态也受pH的影响，在某一反应pH下，二者的解离状态最有利于它们的结合，酶促反应表现出最大活力，此pH称为酶的最适pH；当反应pH偏离最适pH时，酶促反应速度显著下降。2、pH影响酶分子的构象：过高或过低pH都会影响酶分子活性中心的构象，或引起酶的变性失活。第5章酶学

动物体内多数酶的最适pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最适pH约1.8，肝精氨酸酶最适pH约为9.8(见下表)。一些酶的最适pH第5章酶学1903年Henri用蔗糖酶水解蔗糖，研究底物浓度与反应速率的关系；绘制了底物浓度与反应关系的曲线图提出了酶底物中间络合物学说四、底物浓度对酶反应速率的影响第5章酶学第5章酶学当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax第5章酶学随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax第5章酶学当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmax第5章酶学酶催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成中间复合物，然后生成产物，并释放出酶。（一）中间络合物学说第5章酶学（二）酶促反应的动力学方程式1、米氏方程的提出1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程(Michaelisequation)。第5章酶学

研究前提单底物、单产物反应；酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度；底物浓度远远大于酶浓度。（[S]》[E]）第5章酶学三个假设：（1）E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即

V＝k3[ES]。（2）S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。（3）P→0忽略这步反应第5章酶学[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)

Ｋs：米氏常数(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]Ks+[S]＝──第5章酶学2.米氏方程的发展完善及推导稳态：当反应进行一段时间以后，系统的复合物ES的浓度，由零逐渐增加到一定数值，在一定时间内，虽然底物浓度和产物浓度不断变化，复合物ES的不断生成和分解，当反应系统中ES生产速率和分解速率相等时，络合物ES的浓度保持不变称为稳态。第5章酶学稳态时ES浓度不变

反应速度

V=k3[ES]ES的生成速度=消耗速度

k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]E的质量平衡方程

[E]=[Et]-[ES]E+SESP+Ek1k2k3(Ⅲ)(Ⅰ)(Ⅱ)k4第5章酶学1）稳态下[ES]的生产速率2）稳态下[ES]的分解速率3）稳态下[ES]的分解速率和生成速率相等第5章酶学4）由上式推导可得稳态时[ES]5）因酶反应速度与[ES]成正比6）由于S浓度远大于E,当[S]很高时，所有酶被底物饱和形成ES，即[E]=[ES]，反应达最大速率第5章酶学从米氏方程可知：

当底物浓度很低时

[S]<<Km,则V≌Vmax[S]/Km，反应速度与底物浓度呈正比;

当底物浓度很高时，

[S]>>Km，此时V≌Vmax，反应速度达最大速度，底物浓度再增高也不影响反应速度。

当底物浓度与Km接近时[S]=Km，此时V≌1/2Vmax,反应速度为最大反应速度的一半。第5章酶学3.米氏常数的意义（1）.

物理意义：

Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。（2）.Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。（3）.Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。各种酶的Km值范围很广，大致在10-1～10-6M之间。第5章酶学4.Km在实际应用中的重要意义（1）鉴定酶：通过测定可以鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。（2）判断酶的最佳底物：如果一种酶可作用于多个底物,就有几个Km值，其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L),两者相比，蔗糖为该酶的天然底物。（3）计算一定速度下的底物浓度：如某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的99%，则[S]=99Km第5章酶学（4）了解酶的底物在体内具有的浓度水平：一般地，体内酶的天然底物的[S]体内≈Km，如果[S]体内<<Km,那么V<<Vmax，细胞中的酶处于“浪费”状态，反之，[S]体内

>>Km，那么V≈Vmax，底物浓度失去生理意义，也不符合实际状态。（5）判断反应方向或趋势：催化正逆反应的酶，其正逆两向的反应的Km不同，如果正逆反应的底物浓度相当，则反应趋向于Km小对应底物的反应方向。第5章酶学（1）Lineweaver-Burk双倒数作图法5、Km与V的求取第5章酶学第5章酶学蔗糖酶米氏常数（Km）的测定1.配12支蔗糖底物溶液，浓度分别为0、0.005、0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0375、0.050M，在35℃水浴保温；2.加入3U/ml已在35℃水浴保温的酶溶液，准确作用5分钟，终止反应；3.各吸取0.5ml反应液与3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5分钟，冷却后在540nm测定吸光度OD值；4.作图

第5章酶学（2）Eadie-Hofstee作图法第5章酶学vV[S]Vmax斜率－Km第5章酶学五.激活剂对酶反应速度的影响

能使酶活性提高的物质，都称为激活剂(activator)，其中大部分是离子或简单的有机化合物。如Mg++是多种激酶和合成酶的激活剂，动物唾液中的α-淀粉酶则受Cl-的激活。

特点：1、酶对激活剂有一定的选择性，一种酶的激活剂对另一种酶来说可能是抑制剂

2、有一定的浓度要求，当激活剂的浓度超过一定的范围时，它就成为抑制剂。

第5章酶学六、抑制剂对反应速度的影响

凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂(inhibitor)。使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。第5章酶学

（一）酶的抑制作用失活作用：使酶Pr变性而引起酶活力丧失。抑制作用：使酶活力下降但不引起变性。抑制剂：能引起抑制作用的物质。第5章酶学（二）抑制程度的表示方法V0：Vi：不加入抑制剂时的反应速率加入抑制剂后的反应速率以反应速率的变化表示第5章酶学1.相对活力分数（残余活力数）2.相对活力百分数（残余活力百分数）V0ViViV0第5章酶学3.抑制分数——指被抑制而失去活力的分数V0Vi4.抑制百分数ViV0

抑制率第5章酶学

依据：

能否用透析、超滤等物理方法

除去抑制剂，使酶复活。不可逆抑制与可逆抑制（三）抑制作用的分类第5章酶学1、不可逆抑制作用：抑制剂与酶必需基团以牢固的共价键相连很多为剧毒物质重金属、有机磷、有机汞、有机砷、氰化物、青霉素、毒鼠强等。不可逆抑制第5章酶学不可逆抑制剂

非专一性不可逆抑制剂（作用于一/几类基团）

专一性不可逆抑制剂（作用于某一种酶的活性部位基团）2、不可逆抑制剂不可逆抑制第5章酶学

（1）非专一性不可逆抑制剂①重金属离子

Ag+、

Cu2+、

Hg2+、

Pb2+、

Fe3+

高浓度时可使酶蛋白变性失活；低浓度时对酶活性产生抑制。

——通过加入EDTA解除第5章酶学

H2N-CH-COOH

CH2

SH

H2N-CH-COOH

CH2

S-CH2COOHICH2COOHHI②烷化剂（多为卤素化合物）++碘乙酸第5章酶学③有机磷化合物（敌百虫、沙林）第5章酶学胆碱酯酶OHPOC2H5OC2H5S有机磷农药部分第5章酶学胆碱乙酰化酶胆碱酯酶胆碱乙酰胆碱积累导致神经中毒症状第5章酶学如何紧急救治？排毒洗胃、喝鸡蛋清牛奶导泄、利尿血液透析（清除游离状态毒物）解毒药：解磷定第5章酶学ROOROOROXROO—EP+E—OHP+HX有机磷化合物羟基酶磷酰化酶(失活)酸ROOROO—EP+-CHNOH磷酰化酶(失活)N+CH3-CHNN+CH3OOROOR+E—OH

P解磷定解毒------解磷定(PAM)：第5章酶学④有机汞、有机砷化合物——与酶分子中-SH作用；

可通过加入过量巯基化合物解除。第5章酶学⑤氰化物、硫化物和CO

——与酶中金属离子形成稳定的络合物如氰化物与含铁卟啉细胞色素氧化酶结合⑥青霉素（penicillin）与细菌糖肽转肽酶Ser-OH活性，影响细胞壁合成。第5章酶学2.可逆性抑制(reversibleinhibition)

抑制剂与酶以非共价键结合，在用透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复，即抑制剂与酶的结合是可逆的。

第5章酶学1）竞争性抑制(competitiveinhibition)(1)含义和反应式

抑制剂I和底物S结构相似，抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥，已结合底物的ES复合体，不能再结合I。同样已结合抑制剂的EI复合体，不能再结合S。第5章酶学第5章酶学（2）特点：①抑制剂I与底物S在化学结构上相似，能与底物S竞争酶E分子活性中心的结合基团.

例如，丙二酸、苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。第5章酶学

②抑制程度取决于抑制剂与底物的浓度比、〔ES〕和〔EI〕的相对稳定性；③加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。第5章酶学（3）竞争性抑制剂的动力学方程

E+SESE+PE+IEIk1k2k3由米氏方程得：Km＝①

Ki＝②

〔E〕＝〔E〕t－〔ES〕－〔EI〕③〔E〕〔S〕〔ES〕〔E〕〔I〕〔EI〕ki第5章酶学解方程①②③得：〔ES〕=〔E〕t

（1+）＋1Km〔S〕〔I〕Ki又因vi＝k3〔ES〕,代入上式得：Vi＝

（1+）＋〔S〕Km〔I〕KiVmax〔S〕第5章酶学

竞争性抑制剂双倒数曲线，如下图所示：

有竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于纵坐标I/Vmax处，但横坐标的截距，因竞争性抑制存在变小，说明该抑制作用，并不影响酶促反应的最大速度Vmax，而使Km值变大。1vi＝（1+）KmVmax〔s〕1+Vmax1〔I〕Ki第5章酶学

很多药物都是酶的竞争性抑制剂。例如磺胺药与对氨基苯甲酸具有类似的结构，而对氨基苯甲酸、二氢喋呤及谷氨酸是某些细菌合成二氢叶酸的原料，后者能转变为四氢叶酸，它是细菌合成核酸不可缺少的辅酶。由于磺胺药是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂，进而减少细菌体内四氢叶酸的合成，使核酸合成障碍，导致细菌死亡。抗菌增效剂-甲氧苄氨嘧啶(TMP)能特异地抑制细菌的二氢叶酸还原为四氢叶酸，故能增强磺胺药的作用。第5章酶学磺胺药物的抑菌作用第5章酶学2）非竞争性抑制(non-competitiveinhibition)(1)含义和反应式

抑制剂I和底物S与酶E的结合完全互不相关，既不排斥，也不促进结合，抑制剂I可以和酶E结合生成EI，也可以和ES复合物结合生成ESI。底物S和酶E结合成ES后，仍可与I结合生成ESI，但一旦形成ESI复合物，再不能释放形成产物P。第5章酶学第5章酶学（2）特点：①I和S在结构上一般无相似之处，I常与酶分子上结合基团以外的化学基团结合，这种结合并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不能减少I对酶的抑制。②非竞争性抑制剂的双倒数曲线：有非竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于横坐标-1/Km处，但纵坐标的截距，因竞争性抑制存在变大，说明该抑制作用，并不影响酶促反应的Km值，而使Vmax值变小，如下图所示：第5章酶学非竞争性抑制Vi＝Vmax〔S〕(1+)〔I〕KiKm+()〔S〕第5章酶学3）反竞争性抑制(1)含义和反应式

反竞争性抑制剂必须在酶结合了底物之后才能与酶与底物的中间产物结合，该抑制剂与单独的酶不结合。

第5章酶学第5章酶学（2）特点：反竞争性抑制剂存在下，Km、Vmax都变小。1Vi＝KmVmax1〔S〕+1Vmax〔I〕Ki(1+)Vi＝Vmax〔S〕〔S〕〔I〕Ki（1＋）Km＋第5章酶学第5章酶学第五节酶的纯化及活力测定第5章酶学3.5酶的分离纯化及活力测定一、酶的分离提纯（一）酶在细胞中的分布：

胞外酶：水解酶类，易收集，不必破碎细胞，缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液。胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。第5章酶学（二）分离材料：

动植物原料或微生物的发酵液。微生物发酵液是用于分离酶的最常用材料，因为微生物种类多，繁殖快，培养时间短，含酶丰富。由微生物发酵产生的酶或其它生物组织中的酶因含有大量的其它物质，所以必须经过分离、提纯、结晶等阶段才可做实际应用。

对于某种酶的具体制备方案，应通过了解酶的来源、性质及纯度需要来确定，无固定的方案。第5章酶学

（三）原则：

在增加酶得率和纯度的同时，尽可能避免高温、过酸、过碱、剧烈的震荡及其它可能使酶丧失活力的一切操作过程。尽最大可能保存酶的活力。（四）分离提纯：1.酶的抽提：将酶溶解出来就称为抽提。

胞外酶：固体培养的菌体加水或适当缓冲溶液浸泡过滤即可。液体培养的菌体将发酵液离心分离除去菌体收集离心液即可。胞内酶：先破碎细胞，再用水或适当的缓冲溶液抽提。第5章酶学2.酶的纯化：

纯化的关键是维持酶的活性，因为随着酶的逐渐提纯，一些天然的可保持酶活力的其它成分逐渐减少，酶的稳定性变差，所以整个纯化过程应维持低温。（1）酶的沉淀方法：与蛋白质的沉淀方法相同，常用：①盐析法：常用硫酸铵盐析，有分段盐析和一次性盐析两种方法。②有机溶剂沉淀法：用乙醇、丙酮等。应低温操作，溶剂少量分批加入。③等电点沉淀法第5章酶学（2）酶的纯化方法：有吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等.3.酶的结晶：纯化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。4.酶的保存：

一般在-20℃以下低温保存。第5章酶学二、酶活力的测定

定性鉴定提取物中某一酶是否存在，一般是根据此酶引起的化学反应来判断，如检验在提取物中是否存在淀粉酶。则用提取物与淀粉反应，一段时间以后，用碘-碘化钾与反应液反应，若变蓝，说明提取物无淀粉酶活力；反之，提取物有淀粉酶的活力。

酶活力的测定：实际上是酶定量测定的方法，酶制剂因含杂质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。第5章酶学（一）酶活力的概念：

指酶催化特定化学反应的能力。其大小通常用在一定条件下酶催化某一特定化学反应的速度来表示。一定量的酶制剂催化某一化学反应速度快，活力大；反之，活力小。速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，测初速度，多用后者。因为反应初期底物过量，底物的减少量不容易测定，而产物从无到有，易测定。第5章酶学（二）酶的活力单位：

1961年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（IU）规定为：在最适反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位。测定条件：最佳的反应条件，如最适的T（或25℃）、最适pH、[S]>>[E]、初速度下。

1972年国际生化协会又推荐一种新单位，即Katal(Kat)单位。规定：在最适温度下，每秒钟能催化1摩尔底物转化的酶量定义为1Kat。1Kat=60×106IU.第5章酶学第5章酶学(三)酶的比活力：

每单位酶蛋白所含的活力单位数。对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位/mg酶蛋白氮来表示；对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。很明显，比活力越大，酶的活力越大。第5章酶学（五）酶活力的测定方法1、分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质或产物有紫外吸收的能力可采用此法。2、测压法：产物中有气体，测气压增加量。3、滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。4、荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂反应生成荧光产物可用此法。5、旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。

除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。第5章酶学第七节酶的多样性第5章酶学一、变构酶与变构调节（一）调节酶：凡能通过构象变化或亚基解聚或亚基修饰等方式来改变酶活性而对代谢起调节作用的酶称为调节酶。

变构酶又称为别构酶，指调节物与酶分子的调节部位以非共价键结合后，引起酶的构象的改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节作用称为变构调节，具有变构调节的酶称变构酶。凡能使酶分子发生别构作用的物质称为变构剂或调节物调节物能使酶活性增加的效应叫正协同效应，该调节物叫正调节物（如底物）调节物能使酶活性降低的效应叫负协同效应，该调节物叫负调节物第5章酶学变构酶多为寡聚酶，含的亚基数一般为偶数；且分子中有催化部位（结合底物）与调节部位（结合变构剂），这两部位可以在不同的亚基上，或者在同一亚基的两个不同部位。

第5章酶学酶的别构（变构）效应示意图效应剂别构中心活性中心别构酶的反馈调控机理A

（产物或中间产物）EDCB关键酶

—第5章酶学第5章酶学（二）变构酶作用特点1、正协同效应的变构酶其速度-底物浓度曲线呈S形，如大肠杆菌的天冬氨酸转甲酰基酶（ATCase）对底物天冬氨酸的结合表现为正协同效应。2、负协同效应的变构酶其速度-底物浓度曲线为类似双曲线。如3-磷酸甘油醛脱氢酶对NAD+的结合为负协同效应第5章酶学第5章酶学3、由于变构酶动力学不符合米-曼氏酶的动力学，所以当反应速度达到最大速度一半时的底物的浓度，不能用Km表示，而代之以K0.5S表示。第5章酶学（三）生理意义1、在正协同效应的变构酶的S形曲线中段，底物浓度稍有降低，酶的活性明显下降，多酶体系催化的代谢通路可因此而被关闭；反之，底物浓度稍有升高，则酶活性迅速上升，代谢通路又被打开，因此可以通过细胞内底物浓度的变化来灵敏地控制代谢速度。2、变构抑制剂（负调节物）常是代谢通路的终产物，变构酶常处于代谢通路的入口，通过反馈抑制，可以及早地调节整个代谢通路，减少不必要的底物消耗。第5章酶学第5章酶学

例如葡萄糖的氧化分解可提供能量使AMP、ADP转变成ATP，当ATP过多时，通过变构抑制剂ATP抑制磷酸果糖激酶的活性，可限制葡萄糖的分解，而ADP、AMP增多时，则可通过变构激活剂AMP、ADP激活磷酸果糖激酶的活性促进糖的分解。随时调节ATP/ADP的水平，可以维持细胞内能量的正常供应。第5章酶学第5章酶学二、共价调节酶

1、概念：

也称共价修饰酶，通过其它酶对其多肽链某些基团进行可逆共价修饰，使处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性；共价修饰主要是磷酸化、腺苷酰化、甲基化等。共价调节酶是寡聚酶，且在每个亚基上都含有共价修饰的位点。

第5章酶学2、特点：

共价修饰酶通常有活性与非活性两种形式，两种形式之间转换的正、逆反应是由不同的酶催化产生。如骨骼肌中的糖原磷酸化酶有高活性的磷酸化形式与低活性的脱磷酸化形式两种，从脱磷酸化形式转化成磷酸化形式是由磷酸化酶b激酶催化，反之，则是由磷酸化酶磷酸酶催化。第5章酶学反应类型共价修饰被修饰的氨基酸残基共价修饰反应的例子磷酸化腺苷酰化尿苷酰化Tyr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化GluS-腺苷-MetS-腺苷-同型

Cys第5章酶学蛋白质的磷酸化和脱磷酸化

蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质Pn蛋白磷酸酶nPiH2O第一类：Ser/Thr型第二类：Tyr型

第一类：Ser/Thr型第二类：Tyr型第三类：双重底物型第5章酶学第5章酶学

级联系统调控糖原分解示意图意义：由于酶的共价修饰反应是酶促反应，只要有少量信号分子（如激素）存在，即可通过加速这种酶促反应，而使大量的另一种酶发生化学修饰，从而获得放大效应。这种调节方式快速、效率极高。肾上腺素或胰高血糖素1、腺苷酸环化酶（无活性）腺苷酸环化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶（无活性）蛋白激酶（活性）4、磷酸化酶激酶（无活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶b（无活性）磷酸化酶a（活性）6、糖原6-磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖葡萄糖血液ATPADPATPADP肾上腺素或胰高血糖素132102104106108葡萄糖456（极微量）（大量）第5章酶学三、同工酶

同工酶(isoenzyme)是指催化的化学反应相同，酶蛋白的分子组成形式、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。如乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH），具有多种分子组成形式：LDH5（M4）、LDH4（M3H）、LDH3（M2H2）、LDH2（MH3）、LDH1（H4）。第5章酶学乳酸脱氢酶同工酶形成示意图

多肽亚基mRNA四聚体结构基因a

b乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱+–H4MH3M2H2M3HM4点样线第5章酶学

LDH同工酶有组织特异性，LDH1在心肌含量高，而LDH5在肝、骨骼肌含量高。因此，LDH同工酶的相对含量的改变在一定程度上反映了某器官的功能状态，临床上利用这些同工酶在血清中的相对含量的改变作为某脏器病变鉴别诊断的依据。

同工酶也是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分化和癌变的有力工具，在酶学、生物学、和医学中均占有重要地位。第5章酶学LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌肾肝骨骼肌血清-+原点不同组织中LDH同工酶的电泳图谱第5章酶学同工酶在各学科中的应用

(1)遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。(2)发育学：有效地标志细胞类型及细