沈萍微生物学第十章

第十章微生物与基因

工程一、历史回顾40年代－－明确DNA是遗传物质50年代－－DNA双螺旋模型，半保留复制60年代初－－中心法则，操纵子70年代第一节基因工程概述关键性实验技术突破

1，DNA分子切割与连接技术2，载体构建和大肠杆菌转化体系建立3，Southern杂交，DNA序列分析和PCR反应意义；基因工程的定义指对遗传信息的分子操作或施工，按照人的意愿，把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，然后导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物或产生生物新的性状。基因工程的基本过程（1）目的基因的获得

动物，植物，微生物中提取

反转录mRNAcDNA

化学合成（2）优良载体的选择

一个复制子,能大量增殖分子量比较小多种酶单一切点

有选择性标记原核生物－－质粒，噬菌体，真核生物－－SV40(动物），Ti(植物）.（3）目的基因与载体DNA体外重组

限制酶切割产生黏性末端，人工接头低温退火在连接酶作用下共价结合－－杂种分子（4）重组载体导入受体细胞转化－－－质粒转导－－－噬菌体（5）重组受体细胞的筛选与鉴定遗传学方法：插入失活双抗生素对照筛选免疫学方法：用抗血清转化E.coli重组质粒未转化细胞原质粒插入失活双抗生素对照筛选重组质粒培养基含Tet培养基含Tet+Amp培养基含Tet三、微生物与基因工程的关系1、基因资源2、基因工程的载体3、基因工程的工具酶4、基因克隆的宿主5、基因表达的生物反应器6、基因工程理论研究基因组文库用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆，文库中每一克隆只含有特定的基因组DNA片段，含有该生物整套基因组DNA片段的所有克隆就叫做基因组文库.第二节，基因的分离、合成和定位诱变通过一系列酶催化作用，使总poly(A)mRNA转变成dsDNA群体并插入到载体中，转化大肠杆菌细胞，即构成包含所有基因编码序列的cDNA文库cDNA文库二、基因的化学合成1、目前已能合成150——200个核苷酸片段2、应用：合成基因或基因元件合成核酸探针合成DNA引物

三、PCR扩增基因

PCR－聚合酶链式反应一种

体外快速扩增靶DNA技术一，基本原理：与体内DNA复制基本原理相似

95℃

变性dsDNA

ssDNA55℃

退火引物与模板互补

72℃

延伸在引物3－OH加dNTP四、基因的定位诱变1、寡核苷酸指导的定位诱变PCR定位诱变第三节微生物与克隆载体一、质粒载体

pBR322质粒多拷贝质粒相对较小分子量仅4363bp双选择标记Amp,TetAmp,Tet基因中有限制酶切点，可插入外源基因二、λ噬菌体载体有非必需片段可被外源DNA取代能导入寄主，扩增能通过噬菌斑检测有cos位点可成环优点：可克隆23Kb外源DNA，大于质粒载体感染效率达100%

缺点：克隆的外源DNA受限三、柯斯质粒载体

λ噬菌体+质粒具λ噬菌体特性具质粒载体特性具高容量克隆能力优点：可克隆35—48Kb外源DNA

可象质粒那样复制作为载体的一般要求：1.松弛型质粒，自主复制，拷贝数高2.分子量小－－可携带更多的DNA3.有选择性标记－－便于筛选4.多种酶的单一酶切位点－－便于克隆5.易导入和安全性克隆载体－－适宜于外源DNA在受体中扩增的载体。表达载体－－适宜于外源DNA在受体中表达的载体。克隆载体－－适宜于外源DNA在受体中扩增的载体克隆载体的用途：1.用于保存和扩增片段小于2Kb的DNA2.构建cDNA文库3.可用于目的DNA的测序4.作为核酸杂交时的探针来源第四节微生物与基因工程工具酶（1）限制性核酸内切酶定义：是一类能识别和切割dsDNA分子种特定碱基顺序的核酸内切酶命名：EcoRⅠ分离先后顺序寄主菌株或型微生物种名加词宿主，属名分类：Ⅰ型－－无特异位点不产生特异片段。Ⅲ型－－切割点不在识别特异位点处。Ⅱ型－－分子量小，仅仅需Mg2+能识别和切割dsDNA的特异序列，产生特异性片段。识别－－识别序列4－6个碱基，回文结构功能－－产生黏性末端，平末端。（2）DNApolyease①E.coli

polⅠ5/3/

DNApol活性

5/3/

外切酶活性

3/5/

外切酶活性

Klenow片段5/3/

DNApol活性

3/5/外切酶活性测序，末端标记枯草杆菌蛋白酶②TaqDNApolyease

耐热的依赖DNA的DNApolyease,65KD作用温度－－75－80℃也有5/3/端外切酶活性③反转录酶催化以RNA为模板的DNA聚合反应，有5/3/端RNA外切酶活性。可用于cDNA合成。（3）DNA连接酶催化两个独立的DNA片段5/端磷酸基与3/端羟基之间形成磷酸二酯键T4DNA连接