宏基因组学的一般研究策略

宏基因组学的一般研究策略摘要:宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。关键词:宏基因组学,不可培养微生物,文库构建,文库筛选，研究策略StrategiesforaccessingmetagenomicsfordesiredapplicationsAbstract:Metagenomicsisanewfieldofmicrobialgeneticengineering.Ithasthecharacteristicsofmicrobialecologyandthemethodologyofgenomics.MetagenomicsincludesgenomicDNAisolation,libraryconstructionandscreeningstrategies,andcanbeusedinthediscoveryofnewgeneandbiocatalystsandinthestudyofunculturedmicroorganism.Metagenomicscanovercometheadvantagesofisolationandcultivationproceduresintraditionalmicrobialmethod,andthusgreatlybroadenthespaceofmicrobialresourceutilization.Inthispaper,wemainlyreviewedthemetagenomicmethodology,togetherwiththelatestadvancesandnovelstrategyinthisresearchfield.Keywords：Metagenomics;Unculturedmicroorganism；Libraryconstruction；LibraryscreeningResearchstrategies大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%[1]。宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA,避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用[2]。本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。1宏基因组学研究策略1.1宏基因组学概要宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的[3],可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究[4]。其主要过程包括样品和基因的富集和提取;宏基因组文库的构建;目的基因的筛选;目的基因活性产物的表达(图1)。1.2微生物及其基因的富集在文库筛选过程中由于目的基因比例较小,对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5]，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物,常图1环境微生物宏基因组学研究策略[6]Fig.1Generalprocessofmetagenomicstrategie[6]用的就是上面例子中的底物选择法[5]。每一个事物都有其两面性，富集培养虽然扩大了基因的总量，却很容易使部分微生物及其携带的基因丢失。基因水平富集中的稳定同位素探针技术(SIP)很有代表性,它是用稳定同位素标记底物,用相对量较大的原子掺入到具有活性的核酸里,采用密度梯度离心法将其分开,标记的核酸可作为PCR的模板,用来构建宏基因组文库[7]。目前，SIP与宏基因组学结合的报道还不多，但其潜力与优势很明显，利用SIP可提高新基因发现的几率。1.3环境中总DNA的提取宏基因组学要分析的样品成分复杂,要获得高浓度、大片段、无偏好的总DNA是宏基因组学技术的难点，也是其重点。现在提取DNA的方法大体有两种:其一是直接提取法,又称原位提取法，它用化学和物理方法直接裂解样品中的微生物使DNA得以释放,再抽提总DNA,并对DNA进行纯化。其中以Zhou法[8]和Tsai[9]法最为常用。该法操作简便、省时、成本低,能代表某一生境的微生物群落多样性。其缺点是会出现细胞裂解不完全或DNA与样品杂质共沉淀而难以分离,故一般要再进行DNA纯化这一步,它所提取的DNA片段较小(1kb~50kb),适合小片段文库的构建;其二是间接提取法,即异位提取法,是采用差速离心等方法将细胞从样品中分离出,再提取DNA,该法获得的DNA纯度高、DNA片段大(20kb~500kb),适合构建大片段的基因文库。但操作繁琐、成本高、DNA产率低且有偏嗜性,其PCR等方法获得各种细菌rDNA,测序后进行系统学分析,即可描述环境微生物的遗传多样性,使人们对大量不可培养的微生物群体有了全新的认识[37]。例如Tyson[33]等研究了生长在流动的酸矿外排液表面的嗜酸生物膜的群落结构及其代谢途径,从中鉴定出了5个基因,并由微生物之间的基因的功能互补揭示了它们的碳氮固定和产生能量的代谢过程和这些微生物在极端环境中的生存策略[17]。宏基因组扩大了生态学研究的对象,随着分子生物学技术的进步,以功能基因为基础的功能生态学将成为未来的热点，这才是真正意义上的微生态[32]。2.4生物降解作用研究微生物是适应环境能力最强的物种,环境污染往往伴随微生态的变化[34,35]。宏基因组技术可以研究不可培养微生物，发掘它们的基因资源，获得具有某些物质降解能力的活性物质，进而了解特定环境下微生物或活性物质的耐受机理，用于污染的修复。如，我们可建立污染地域的宏基因组文库，筛选具有某污染物降解能力的克隆再用遗传工程手段，把从宏基因组中分离出的基因组编成具有其他活性成分、或可降解污染物功能的基因簇用于污染物的处理。Kube[36]等建立了黑海海床的Fosmid文库，筛选到了厌氧环境下苯甲酸盐类降解相关酶的基因，经过生物信息学分析后，完成了苯甲酸盐的厌氧代谢通路，并找到了控制此过程的关键基因。可见本技术对解决三废问题，实现可持续发展有一定的意义。3结语与展望宏基因组学作为一门新兴学科，展示出强大的生命力与潜力，越来越多的科研人员将眼光投向它，其重心也从多样性分析转移到活性物质的筛选上来[37]。虽然该技术在应有上硕果累累。但由于它刚刚起步,还有些技术方法不够成熟。主要有三方面[38-43]，一是DNA的提取方法需进一步完善，外源基因表达量少和缺乏高效的筛选方法。二是对更适宜的载体的探索真核表达宿主细胞的开发，研究和探索多种真菌宿主势在必行。三是需要把宏基因组学与生物信息学和生物芯片技术等结合起来，生物信息学为宏基因组复杂的序列信息的分析提供了方便。如芯片技术已用于检测微生物群落的基因表达。随着文库构建和筛选策略的不断提高,异源基因表达能力和产量的增加,宏基因组学技术将成为研究环境微生物多样性,筛选新的功能基因和生物活性物质的重要手段，它的前景是很诱人的，相信经过我们不断的摸索与创新，并结合现在先进的仪器与技术，它将会发展成为生物学中璀璨的一颗明珠，更好的发挥出它应有的潜力。参考文献：[1]李丽娟,张殿昌,龚世园.宏基因组技术在开发未培养微生物资源中的应用[J].水利渔业,2007,27(3):7-9.[2]丁维俊,董婷,曾庆秋.从宏基因组学谈中医整体观的现代化[J].四川中医,2008,26(6):26-28.[3]SuzanPantarotodeVasconcellos,CélioFernandoFigueiredoAngolini,IsabelNataliaSierraGarcía,BrunaMartinsDellagnezze,CynthiaCanedodaSilva,AnitaJocelyneMarsaioli,EugenioVazdosSantosNeto,ValériaMaiadeOliveira.Reprintof:ScreeningforhydrocarbonbiodegradersinametagenomicclonelibraryderivedfromBrazilianpetroleumreservoirs.OrganicGeochemistry41(2010)1067-1073[4]VenterJC,RemingtonK,HeidelbergJF,etal.EnvironmentalgenomeshotgunsequencingoftheSargassoSea.Science,2004,304(5667):66-74.[5]SchlossPD,HandelsmanJ.Biotechnologicalprospectsfrommetagenomics.CurrOpinBiotechnol,2003,14(3):303-310.[6]黄循柳，黄仕杰，郭丽琼，林俊芳宏基因组学研究进展微生物学通报2009,36(7):1058-1066[7]JeonCO,ParkW,PadmanabhanP,etal.Discoveryofabacteriumwithdistinctivedioxygenasethatisresponsibleforinsitubiodegradationincontaminatedsediment.ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(23):13591-13596.[8]KavitaS.Kakirde,LarissaC.Parsley,MarkR.Liles.Sizedoesmatter:Application-drivenapproachesforsoilmetagenomics.SoilBiology&Biochemistry42(2010)1911-1923[9]NicolaSegata1,JacquesIzard,LeviWaldron,DirkGevers,LarisaMiropolsky,WendySGarrettandCurtisHuttenhower.Metagenomicbiomarkerdiscoveryandexplanation.GenomeBiology2011,12:R6[10]DanielR.TheMetagenomicsofsoil.NatureReviewsMicrobiology,2005,3(6):470-478.[11]ParkHJ,JeonJH,KangSG,etal.FunctionalexpressionandrefoldingofnewalkalineesteraseEM2L8fromdeepseasedimentmetagenome.ProteinExpressionandPurication,2007,52(2):340-347.[12]LeeDG,JeonJH,J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