新教材适用2023-2024学年高中生物第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具学案新人教版选择性必修3

第1节重组DNA技术的基本工具课标要求1．简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。2．认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3．进行DNA的粗提取与鉴定。核心素养1．科学思维——模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。2．社会责任——关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生了基因工程。知识点一基因工程的概念与限制性内切核酸酶基础知识·双基夯实一、基因工程的概念1．操作场所：_生物体外__。2．操作技术：_转基因__等技术。3．操作结果：赋予生物新的_遗传特性__，创造出更符合人们需要的新的_生物类型__和生物产品。4．操作水平：_DNA分子__水平。二、重组DNA技术的基本工具限制性内切核酸酶(又称限制酶)——“分子手术刀”1．来源：主要来自_原核生物__。2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定_核苷酸序列__，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_磷酸二酯键__断开。3．结果：产生_黏性末端__或_平末端__。活|学|巧|练1.基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。(√)2．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。(×)3．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。(√)合|作|探|究为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。课内探究·名师点睛1．限制酶作用特点(1)切割外源DNA，对自身的DNA不起作用，从而达到保护自身的目的。(2)专一性：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。2．限制酶作用结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。(1)黏性末端：错位切，在识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开，产生的是黏性末端，如下图。(2)平末端：平切，沿着识别序列的中心轴线切开，产生的是平末端，如下图。3．限制酶的识别序列和切割末端的判断(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如右图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(CCAGG,GGTCC))以eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(A,T))为轴，两侧碱基互补对称。(2)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割，但同样能相互连接。典例1如图表示限制酶切割某DNA分子的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切割位点是(C)A．5′－CTTAAG－3′，切点在C和T之间B．5′－CTTAAG－3′，切点在G和A之间C．5′－GAATTC－3′，切点在G和A之间D．5′－CTTAAC－3′，切点在C和T之间解析：两条链均按照5′→3′方向分析，由题图可知该限制酶识别的碱基序列为5′－GAATTC－3′，并在G与A之间断开磷酸二酯键，故选C。变式训练❶对下图所示黏性末端的说法，正确的是(C)A．甲、乙、丙黏性末端是由两种限制性内切核酸酶作用产生的B．图乙中的酶切位点在A与G之间C．如果甲中的G突变为A，则原限制性内切核酸酶不能识别该切割位点D．构建基因表达载体所用的限制酶和DNA连接酶分别作用于a处和b处解析：根据题图结果可知，切割甲的限制酶的识别序列是—GAATTC—，切割乙的限制酶的识别序列是—CAATTG—，切割丙的限制酶的识别序列是—CTTAAG—，故甲、乙、丙三个黏性末端是由三种限制酶作用产生的，A项错误；图乙中的酶切位点在A与C之间，而不是A与G之间，B项错误；限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，如果甲中的G发生突变，则限制酶不能识别该切割位点，C项正确；构建基因表达载体所用的限制酶和DNA连接酶的作用位点均是磷酸二酯键即a处，b处为氢键，D项错误。知识点二DNA连接酶及与DNA分子相关的几种酶的分析基础知识·双基夯实(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_磷酸二酯键__。(2)种类[填表]种类比较E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源_大肠杆菌___T4噬菌体__特点只能连接_黏性末端__既可以连接黏性末端，又可以连接_平末端__活|学|巧|练1.E.coliDNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。(×)2．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键形成重组DNA。(×)3．DNA连接酶能连接所有相同或互补的黏性末端，故该酶没有专一性。(×)合|作|探|究限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E.coliDNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。课内探究·名师点睛1．限制酶与DNA连接酶的比较项目限制酶DNA连接酶不同点作用使特定部位的磷酸二酯键断裂在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键应用用于提取目的基因和切割载体用于基因表达载体的构建关系2.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较种类DNA连接酶DNA聚合酶相同点催化形成磷酸二酯键不同点模板不需要模板需要以DNA的一条链为模板作用过程在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键作用结果形成完整的DNA分子形成DNA的一条链用途基因工程等DNA复制3.限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶、解旋酶的作用部位图解(1)作用于磷酸二酯键的酶：限制酶(a断开)、DNA连接酶(a形成)和DNA聚合酶(a形成)、DNA水解酶(a断开)。(2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶。氢键的形成是由于分子间的作用力，其断裂与重新形成均与限制酶、DNA连接酶无关。典例2下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是(C)A．T4DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来B．E.coliDNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸解析：T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，A错误；E.coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接，B错误；DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接起来，C正确，D错误。变式训练❷在基因工程操作过程中，DNA连接酶的作用是(C)A．将任意两个DNA片段连接起来B．将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来，包括DNA片段和碱基对之间的氢键C．连接具有互补黏性末端或平末端的DNA片段，即形成磷酸二酯键D．只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键解析：DNA连接酶将具有互补的黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。知识点三基因进入受体细胞的载体基础知识·双基夯实1．质粒(1)质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于_真核细胞的细胞核__或_原核细胞拟核DNA__之外，并具有_自我复制__能力的环状双链DNA分子。(2)质粒适于作基因运载体的特点①质粒分子上有一个至多个_限制酶切割__位点，供外源DNA片段插入其中。②携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中_进行自我复制__，或_整合到受体DNA上__，随_受体细胞DNA__同步复制。③人工改造的质粒常带有_标记基因__，便于_重组DNA分子的筛选__。2．噬菌体、动植物病毒等。活|学|巧|练1.载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。(√)2．所有的质粒都可以作为载体。(×)3．基因工程中的载体与细胞膜上的载体成分一样。(×)合|作|探|究1.所有载体都是质粒吗？为什么？提示：不是；除了质粒外，载体还有动植物病毒和噬菌体。2．将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？提示：不可行；因为如果没有载体，导入受体细胞后，目的基因无法进行自我复制和稳定存在以及表达。3．质粒上的一些抗生素抗性基因有什么作用？提示：作为标记基因，对重组DNA进行筛选，检测目的基因是否导入受体细胞。课内探究·名师点睛1．载体的功能(1)作为运载工具将目的基因转运到宿主细胞内。(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。2．常用的载体——质粒(1)存在场所：细菌、真菌等生物的细胞质。(2)本质：环状DNA分子。(3)特点：含有标记基因。(4)载体必须具备的条件①能在受体细胞内稳定保存并大量复制。②有一至多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。③具有某些标记基因，以便进行筛选。④载体应对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。基因工程中的载体与载体蛋白的区别基因工程中的载体载体蛋白来源质粒、噬菌体、动植物病毒细胞膜上的蛋白质作用将目的基因转移到宿主细胞中，并能在宿主细胞中对目的基因进行大量复制运载要进出细胞的某些物质典例3质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是(D)A．质粒是只存在于原核细胞的细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择解析：质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布，A项错误；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点而成为合适的运载目的基因的工具，B项错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C项错误；质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择，D项正确。变式训练❸某研究所的研究人员拟将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，目的基因要插入到基因B中，且大肠杆菌本身不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是(D)A．导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒B．抗生素抗性基因是目的基因表达的必要条件C．成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基上生长D．能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌不一定符合生产要求解析：导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒，也可能为普通质粒，A错误；抗生素抗性基因是标记基因，是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，与目的基因表达无关，B错误；由于目的基因要插入到基因B中，即抗氨苄青霉素基因被破坏，工程菌不能抗氨苄青霉素，因此成功导入重组质粒的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，C错误；能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌可能含有重组质粒或普通质粒，因此不一定符合生产要求，D正确。知识点四DNA的粗提取与鉴定基础知识·双基夯实1．实验原理(1)_DNA__不溶于酒精，_蛋白质__溶于酒精。(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于_2_mol/L的NaCl__溶液。(3)在一定温度下，DNA遇_二苯胺__试剂会呈现蓝色。2．实验步骤(1)称取30g洋葱，切碎，加入10mL研磨液，充分研磨。↓(2)漏斗中垫_纱布__，将研磨液过滤到烧杯中，_4__℃处理，取上清液。↓(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的_酒精__溶液，静置2～3min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。↓(4)取两支20mL的试管编号A、B，各加入2mol/L的_NaCl__溶液5mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4mL的_二苯胺试剂__。混匀后，将试管置于_沸水__中加热5min。↓(5)结果观察：A试管_不变蓝__，B试管_变蓝色__。活|学|巧|练1.DNA与蛋白质都溶于酒精。(×)2．在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。(×)3．DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液。(√)合|作|探|究1.鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？请说明理由。提示：鸟类适合而哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，不适合作材料提取DNA。2．实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状物或沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。3．实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。课内探究·名师点睛1．实验材料的选取原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。选取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。2．方法步骤(1)粗提取DNA(2)鉴定DNA试管编号A(对照组)B(实验组)步骤12mol·L－1的NaCl溶液5mL2mol·L－1的NaCl溶液5mL步骤2不进行任何处理加丝状物或沉淀物步骤3加4mL二苯胺试剂，混匀加4mL二苯胺试剂，混匀步骤4沸水浴5min沸水浴5min实验现象溶液不变蓝色溶液逐渐变为蓝色实验结论DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色特别提醒：(1)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质和脂质。(2)不用哺乳动物的血液作为实验材料，这是因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，不含DNA。(3)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。(4)沉淀DNA时必须用冷酒精。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，使DNA易形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。典例4下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(A)A．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近B．DNA析出过程中，用玻璃棒沿同一方向轻轻搅拌C．预冷的乙醇可用来溶解蛋白质D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热解析：猪属于哺乳动物，其红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，而鸡属于鸟类，其红细胞内含有细胞核与各种细胞器，DNA含量较多，A项错误；在除去相关蛋白后，DNA是非常容易断裂的，如果太过剧烈地搅拌，DNA链可能会被破坏，因此轻柔搅拌的目的是为了获得较完整的DNA分子，B项正确；在冷的95%酒精溶液中DNA的溶解度低，DNA的沉淀量大，C项正确；将析出的DNA溶解在2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要水浴加热才会呈现蓝色，D项正确。变式训练❹如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列有关叙述错误的是(B)A．图1中的丝状物含有DNAB．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶C．图2所示实验操作完成后，最好待试管中溶液冷却后观察颜色变化D．图2中的溶液b能够溶解DNA解析：图1中的丝状物含有DNA，A正确；图1所示操作的原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质溶于酒精，B错误；图2所示实验操作完成后，最好待试管中溶液冷却后观察颜色变化，C正确；图2中的溶液b是NaCl溶液，能够溶解DNA，D正确。选择限制酶的方法根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。典例5利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点分别如下图所示(已知这三种限制酶切割产生的黏性末端不同)。下列分析错误的是(D)A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA解析：构建重组DNA时，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A项正确；分析图甲，HindⅢ的酶切位点在第二个EcoRⅠ的酶切位点的左侧，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B项正确；P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为链状DNA分子，因每条DNA单链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C项正确；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可正向连接或反向连接，不止能产生一种重组DNA，D项错误。学|霸|记|忆1.基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。2．DNA重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。3．限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。4．E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。5．质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。8．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。9．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。1．下列关于E.coliDNA连接酶的叙述，正确的是(A)①催化具有相同黏性末端的DNA片段之间的连接②催化具有互补黏性末端的DNA片段之间的连接③催化具有平末端的DNA片段之间的连接④催化单个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成A．①② B．②④C．②③ D．①④解析：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，可用于连接相同或互补的黏性末端，不能连接平末端；T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接平末端的效率相对较低。DNA连接酶不能连接单个的脱氧核苷酸，在DNA复制时，靠DNA聚合酶将单个的脱氧核苷酸聚合在一起。2．用X酶切割DNA分子后，得到黏性末端①，用Y酶切割DNA分子后，得到黏性末端②，如图所示，以下说法不