三碱性磷酸酶的分离纯化和Km测定

其次局部碱性磷酸酶Km测定一、试验目的把握碱性磷酸酶的的动力学鉴定—Km鉴定二、试验原理当温度、pH及酶浓度恒定的条件下，酶促反响的初速度随作用物浓度[S]增大而增大，但增大到肯定限度时，作用物浓度再增加，则反响速度不再增加。此时反响速度为最大速度〔Vmax〕。MichaelisMenten对酶促反响速度与作用物浓度之间的这种关系进展了大量试验争论，并于1913年提出了数学方程式，即著名的米一曼方程式：

作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为1/Km，依据在横轴上的截距，可以计算出该酶的Km。

本试验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物，依据红色深浅可测出酶活力凹凸。其反响式如下：

磷酸苯二钠磷酸盐+酚AKP酚+4-氨基安替比林红色醌类衍生物铁氰化钾PH10碱性利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性〔A〕，按Lieweaver-Burk二氏法作图，从x轴上的截距求得其Km值。三、试验仪器及试剂仪器：恒温水浴锅，721型分光光度计。试剂：

1.0.04mol/L作用物液：称取10.16g磷酸苯二钠〔C6H5PO4Na2·2H2O〕，用煮沸后冷却的蒸溜水溶解，并稀释至1,000ml，4ml氯仿防腐，加贮于棕色瓶内，置冰箱内保存，可用一周。

2.0.1mol碳酸盐缓冲液〔pH10.0〕：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.

3.碱性磷酸酶液：用自己提取的碱性磷酸酶液，用

pH10缓冲液稀释

5-7倍。0.5mol/LNaOH

溶液0.3%4-氨基安替比林：称取

3g4氨基安替比林及碳酸氢钠

42g，用蒸馏水溶解，并稀释至

1,000ml，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存。0.5%铁氰化钾：称取

10g铁氰化钾及

30g硼酸各溶于

800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至

2,000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存。四、操作步骤1、取大试管

7支，按下表操作：参加酶液，混匀之后马上计时，各管在37℃水浴中准确保温15分钟后，立即参加0.5MolNaOH液1.0ml以终止反响。

2、显色：各管中参加0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%铁氰化钾2.0ml，充分混匀，放置10分钟，以0管为比照，在波长510nm下比色，记录各管的吸光度。3、作图：所测各管的吸光度代表各管中反响速度V，以之为纵轴，以作用物浓度[S]为横轴，在坐标纸上连接各点作图，观看曲线的外形。以各管吸光度值的倒数为纵坐标，以作用物浓度的倒数为横坐标，作图并求此酶的Km值。五、试验结果〔1〕说说碱性磷酸酶提取过程中的留意事项〔2〕计算碱性磷酸酶的Km值单项选择题：1．下面关于酶的描述，哪一项不正确：A

A、全部的酶都是蛋白质

B、酶是生物催化剂

C、酶具有专一性

D、酶是在细胞内合成的，但也可以在细胞外发挥催化功能2．一个简洁的米氏酶催化反响，当[S]<<Km时：B

A、反响速度最大

B、底物浓度与反响速度成正比

C、增加酶浓度，反响速度显著变大

D、[S]浓度增加，Km值也随之变大3．酶的比活力是指：B

A、任何纯酶的活力与其粗酶的活力比

B、每毫克蛋白的酶活力单位数

C、每毫升反响混合液的活力单位

D、以某种酶的活力作为1来表示其他酶的相对活力是非题：1．假设有一个适