杉木愈伤组织的农杆菌转化条件优化

杉木愈伤组织的农杆菌转化条件优化

f.木材是世界著名的热带树种。它生长迅速，材料齐全。广泛应用于造船、桥梁、建筑、高级家具和雕塑等领域。木兰也是中国亚热带和南亚热带最重要的造林和经济树种。种植在9个省、60多个市（市），总面积约2万公顷。中国没有树木的自然分布，物种资源极度不足。种植的普及受到土壤ph、低温冻害、锈病和野生水稻等问题的严重影响。采用传统育种方法开发秋葵移植技术，培育抗寒性、抗虫、抗病性和速生转换剂对加快我国秋葵的普及栽培具有重要意义。从叶盘、茎段、胚轴、子叶等外植体上诱导并转化愈伤组织,然后再生出转基因植株是植物转基因的重要方法之一.本文中优化了柚木茎段愈伤组织的农杆菌转化条件,为柚木转基因技术研究、转基因育种研究和功能基因学研究奠定了基础.1试验材料和方法1.1愈伤组织诱导叶片外植体诱导取具有4～5对叶片、高度为6～8cm的无菌试管苗,切取长度为1.2～1.5cm、不带腋芽的茎段进行愈伤组织诱导,以愈伤组织连同茎段一起作外植体进行转基因参数的优化.农杆菌则采用含有双元载体pAL4404和pBI121的常用菌株LBA4404.1.2测试方法1.2.1农杆菌的培养愈伤组织诱导的培养基为MS+BA0.5mg/L,光照强度为2500lx,光照时间为10h,培养温度为26～28℃.农杆菌的培养参照《植物基因工程》的方法.愈伤组织与农杆菌共培养的条件与愈伤组织相同.1.2.2植物ph试验预培养时间试验设置7、9、11、13、15、17d6种处理;共培养时间试验设置7、9、11、13d4种处理;共培养pH试验设置6.2、6.0、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0这7种处理;菌液光密度(OD值)试验设置0.3～0.4、0.4～0.5、0.5～0.6、0.6～0.7、0.7～0.8、0.8～0.9这6种处理,因菌液光密度难以控制,部分处理的光密度与试验设计略有偏差.采用7813、7557、108和7531这4个无性系进行农杆菌转化敏感性的无性系差异测定.1.2.3做好个案研究所有试验的每个处理重复8瓶,每瓶6个茎段,共48个重复.由于实际操作中存在一定的污染率,每个处理比预定的重复瓶数增加2～3瓶,以确保每个处理到调查时有足够的瓶数.如果没有污染,多余的瓶数则随机去除.1.2.4染色gus参照《植物分子实验指南》的方法,共培养结束后即进行GUS染色.1.2.5死亡鉴定在实体显微镜下放大40倍观察愈伤组织的GUS染色结果,调查指标有愈伤组织蓝斑数、茎段表皮蓝斑数、愈伤组织颜色、愈伤组织质量、愈伤组织死亡率和茎段外植体死亡率.正常的柚木愈伤组织为白色、淡绿色或淡黄色,愈伤组织变成黑褐色和水浸状时视为死亡.正常茎段的表皮颜色为绿色或淡绿色,茎段变成深黄色或褐色时视为死亡.2结果与分析2.1预培养7d/茎段蓝斑的增加预培养使得外植体的细胞处于旺盛的细胞分裂和生长状态,从而容易被农杆菌转化.表1显示,愈伤组织蓝斑数从预培养7d的12.76个/茎段逐渐增加至11d的25.64个/茎段,13d和15d的蓝斑数量相对稳定,而超过17d,蓝斑数量呈下降趋势;愈伤组织的有斑率则变动不大,均在60.0%～65.9%范围内.因此,LBA4404转化柚木愈伤组织时预培养11～15d为佳.2.2d时愈伤组织蓝斑数由表2可知,7557愈伤组织与LBA4404共培养的时间少于9d时,愈伤组织蓝斑数小于1.3个/茎段;当共培养时间达到13d时,愈伤组织蓝斑数量最高,为16.06个/茎段.因此共培养天数以13d为好,茎段愈伤组织蓝斑数量最多,愈伤组织有蓝斑率也最高.2.3不同ph值对转化减作剂转化效率的影响由表3可知,LBA4404对108无性系愈伤组织的转化效率随pH值的降低而呈现下降趋势,当pH值低于5.4时,转化效率显著下降.茎段愈伤组织蓝斑数的方差分析结果显示,pH值在5.6至6.2之间差异不显著,但显著高于pH为5.0至5.4.因此,适宜于LBA4404转化柚木愈伤组织的共培养pH为5.6～6.2.但是,适宜于LBA4404转化茎段表皮细胞的pH则为5.2～5.8,与适宜于转化愈伤组织的pH值范围有所不同.2.4菌液浓度及数量处于对数生长期的农杆菌转化效率最高,但对数生长初期的菌液浓度比较小,农杆菌个体数量不足.光密度是菌液浓度的最好指标,当菌液光密度OD600小于0.3时,农杆菌个体数量不足;光密度超过1.0后,培养基的养分和氧气供应不足,农杆菌菌液中死亡个体的比例增加,多数情况下不适宜于转化.LBA4404转化8301愈伤组织的结果表明,光密度在0.498至0.805的范围内均有较高的转化效率(见表4).2.5个愈伤组织的转化不同基因型或无性系对农杆菌的侵染具有不同的敏感性.LBA4404对7813、108和7531这3个无性系的愈伤组织均具有较高的转化效率,而对其茎段表皮细胞的转化频率则比较低;7557则相反,愈伤组织的转化效率低,而茎段表皮细胞的转化效率高,蓝斑数量显著高于其它3个无性系.因此,对柚木无性系进行筛选,选择容易被农杆菌侵染的无性系开展转基因研究.2.6农杆菌工程菌液的制备及验证农杆菌工程菌液中含有50mg/L的卡那霉素.若直接用于接种,植物细胞受卡那霉素的影响而失去部分活力,感受态细胞数量减少,导致转化效率降低.对比试验结果表明,用重新悬浮、不含卡那霉素的农杆菌液进行转化,愈伤组织和茎段表皮的蓝斑数量与未重新悬浮的对照相比显著提高(见表6).说明卡那霉素对柚木愈伤组织和表皮细胞的影响大,农杆菌工程菌液宜用柚木液体培养基重新悬浮后再用于接种.在共培养基中附加100μmol/L的乙酰丁香酮(AS)后,茎段愈伤组织的平均蓝斑数略有降低,说明乙酰丁香酮对柚木愈伤组织的转化没有促进作用(见表7).可能原因是柚木为双子叶植物,本身可以分泌足够数量的信号物质,诱导农杆菌附着愈伤组织并活化Vir区基因.3共培养ph值对农杆菌vir基因表达的影响共培养时间是农杆菌转化植物细胞的重要技术参数之一.因细胞结构的差异、释放的受伤信号强弱不同、忍受农杆菌危害的能力不同,不同植物最适宜的共培养时间差异较大.水稻、棉花、马铃薯等多数农作物的最适共培养时间为2～6d,桉树、木麻黄、杨树、白桦等多数林木为3～6d.柚木愈伤组织与LBA4404的适宜共培养时间为13d,比常见植物种类的2～6d长了许多.共培养时间长、农杆菌过度生长会对植物细胞产生毒害作用,导致植物组织的死亡和转化效率的降低.但柚木茎段与LBA4404共培养5d后茎段外植体和愈伤组织未受明显影响,共培养15d时,愈伤组织死亡率仅为6.3%.可见,LBA4404侵染柚木时对愈伤组织和茎段的致死作用比较小.除转化愈伤组织外,LBA4404还转化柚木茎段的表皮细胞,平均每个茎段的表皮蓝斑数在3.69至21.67个之间.不过,随着预培养时间的增长,茎段表皮细胞的转化效率呈明显下降趋势.可能是由于茎段的内部营养逐渐用于形成愈伤组织,活力逐渐下降的缘故.试验观察还发现,随着预培养时间的延长和愈伤组织的萌发与增大,茎段表皮由绿色逐渐转变为淡绿色,最终变成浅黄色.pH值对农杆菌Vir区基因的活化和表达有显著的影响,当培养基的pH值低于6.0时,比较适宜于农杆菌Vir基因的诱导表达.柚木是一种不耐酸性的树种,土壤的pH值为6.5左右时最适宜于生长.柚木外植体的愈伤组织诱导和增殖培养适宜的培养基pH值也比较高,为6.0～6.4.因此,选择合适的共培养pH值,既满足农杆菌Vir区基因活化的要求,又适宜于愈伤组织的生长成了转化条件优化的关键之一.本研究结果显示,柚木愈伤组织的转化效率随pH值的减小而降低,pH值小于5.6时转化效率显著下降,因为pH值越低越不适合愈伤组织的生长.柚木愈伤组织适宜的共培养pH值为5.6～6.2,比其它植物种类要求的6.0以下略高.共培养pH为5.6～6.2的适宜范围既满足了柚木愈伤组织生长的要求,又兼顾了农杆菌Vir区基因活化的要求.受伤植物组织分泌的