人胰腺癌阿霉素耐药细胞株sw950adm的建立及耐药机理研究

人胰腺癌阿霉素耐药细胞株sw950adm的建立及耐药机理研究

多药残留基因mdr1是许多肿瘤化疗失败的原因之一。外瘤抗生素的形成对阐明肿瘤的抗药机和筛选化疗药物具有重要的理论和实践价值。我们的先期研究发现,胰腺癌细胞株SW1990的先天性耐药与多药耐药基因mdr1的表达呈正相关性。在此基础上,我们试图通过建立胰腺癌耐药细胞株,以进一步探讨其获得性耐药机理。1材料和方法1.1rt-pcr试剂阿霉素(ADM)等化疗药物由日本明治制药有限公司出品;MTT为FIUKA公司产品;RT-PCR试剂购于美国Gibco公司;Rhodamine123(罗丹明)为美国Sigma公司产品;人胰腺癌细胞株SW1990由解放军总医院肿瘤生物研究室提供使用。1.2细胞死亡情况观察采用浓度梯度倍增法诱导建立耐药细胞株SW1990/ADM。首先分别向生长有SW1990细胞株的培养瓶内加入不同浓度的ADM,培养1周后观察细胞死亡情况。选择可将80%的细胞杀死的药物浓度(ID80)作为耐药细胞培养的起始浓度;然后将肿瘤细胞置于含有ID80药物的培养液中培养,24h后更换不含药物的1640培养液继续培养。待细胞稳定生长、进入对数生长期后,传代两次,再将细胞株于加倍剂量(2×ID80)的ADM中继续培养;依此类推,共经过9个浓度梯度、约10个月的培养,最后脱药培养2个月后备用。1.3sw1990对adm菌的生物学特性的检测1.3.1社会学观察将两株细胞分别爬片后经HE染色,光镜下进行形态学观察;再分别收集两株细胞,固定后电镜下行超微结构观察。1.3.2通过微分时间测定和微细胞周期分析细胞培养和复孔观察取对数生长期的亲本及耐药细胞各一瓶,0.25%胰酶消化,10%小牛血清-1640培养液制成浓度为1×104个/ml的单细胞悬液,24孔板中每孔接种1ml,37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养。每天取3个复孔计数活细胞,计算平均值,连续观察7d。以培养时间为横轴,以细胞数的对数为纵轴,绘制半对数细胞生长曲线,于生长曲线上对数生长期内取3组数据,根据最小二乘法进行直线回归,在直线上任取两点(N、N0),根据下列公式计算细胞的倍增时间(dt)(式中t代表N0～N的时间):dt=0.693tlgΝΝ0dt=0.693tlgNN02.细胞周期分析取对数生长期的亲本及耐药细胞各1×106个/ml,制成单细胞悬液,按试剂盒说明进行操作,于流式细胞仪(FCM)上行细胞周期分析。1.3.3cea及ca19-9对cea、ca19-9、cea、ca19-9细胞培养液的制备分别将同等数量的亲本及耐药细胞接种于培养瓶内,37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养,待细胞进入对数生长期后,分别收集培养液各10ml,1000r/min离心5min后取上清,行CEA及CA19-9的检测。1.4化疗药物的复孔、化疗联合拉米、mmc的制备收集亲本及耐药胰腺癌细胞株,分别制成浓度为5×104个/ml的单细胞悬液,接种于96孔板,每孔200μl。实验分两组:①单纯化疗组,分别加入4种不同浓度梯度的化疗药物,即氟尿嘧啶(5-FU,0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml、5000μg/ml)、健择(GEM,0.375μg/ml、3.75μg/ml、37.5μg/ml、375μg/ml、3750μg/ml、37500μg/ml)、ADM(0.015μg/ml、0.15μg/ml、1.5μg/ml、15μg/ml、150μg/ml)、丝裂霉素(MMC,0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml),每个药物浓度设6个复孔;另设6个复孔不加药物作为空白对照组。②化疗联合维拉帕米(Ver)组(简称联合化疗组),先加入终浓度为4.5μmol/L的Ver,1h后分别加入上述4种不同浓度梯度的化疗药物,每个药物浓度设6个复孔;另设6个复孔只加入终浓度为4.5μmol/L的Ver作为对照。37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养48h。更换培养液,同时加入5mg/mlMTT20μl/孔,继续培养4h,可见有不同程度的蓝紫色(Formazo)结晶,加入二甲基亚砜100μl/孔,于酶标仪上振荡3min,使结晶溶解,测波长570nm处吸光度(A)值。计算各组A值的平均值,以空白对照组的细胞生存率作为100%,用下列公式求出每种药物浓度对细胞的抑制率:抑制率=1-加药组A值对照组A值×100%=1−加药组A值对照组A值×100%以药物浓度的对数为横坐标,以细胞抑制率为纵坐标绘制半对数曲线,SPSS软件行直线回归,计算50%抑制浓度(IC50)及耐药指数(RI):RΙ=耐药细胞株ΙC50亲本细胞株ΙC50RI=耐药细胞株IC50亲本细胞株IC501.5罗丹明和罗丹明法分别收集亲本及耐药胰腺癌细胞各1×106个/ml,1000r/min离心5min,弃上清,重悬于2ml1640培养液。实验分两组:单纯罗丹明组(加入终浓度为0.15μg/ml的罗丹明)和罗丹明+Ver组(先加入终浓度为4.5μmol/L的Ver,1h后再加入终浓度为0.15μg/ml的罗丹明)。37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养30min。PBS洗涤细胞两次,重悬于1640培养液中。37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养10min,1000r/min离心5min,重悬于0.5mlPBS液中,立即以FCM测定阳性细胞百分比。1.6n失活反应细胞总RNA提取参照TrizolReagent试剂盒说明书进行。①逆转录合成cDNA:将RNA稀释为1μg/μl,在20μl反应体积中用5μg的RNA合成cDNA:42℃水浴50min,在70℃15min失活反应。②PCR扩增:PCR引物分别根据Genebank中人mdr1和β-actincDNA序列进行设计。mdr1上游引物:5′-ACTGAGCCTGGAGGTGAAGA-3′,下游引物:5′-CCACCAGAGAGCTGAGTTCC-3′;β-actin上游引物:5′-AACTGGGACATGGAGAAAATC-3′,下游引物:5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。反应条件:95℃灭活5min,94℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸1min,共35个循环。取5μlPCR产物,于含0.6%溴化乙啶的1.0%琼脂糖凝胶,100V电压条件下电泳。紫外灯下照相并分析。PCR产物长度为570bp。1.7统计处理SPSS软件对实验数据进行协方差分析,检验水准α=0.05。2结果2.1sw1929/adm在组织学上的改变经过10个月的体外药物培养,我们得到稳定传代的耐药细胞株,脱药培养2个月后与亲本细胞株SW1990相比,SW1990/ADM在形态学上发生了明显的改变。光镜下见细胞变圆、体积增大、胞浆内颗粒样物质增多。电镜下见细胞膜表面微绒毛增多,细胞膜表面积变大,胞浆细胞器数目增多,线粒体嵴紊乱、基质出现空泡;内质网扩张,胞浆内空泡结构增多(见图1)。2.2细胞间肿瘤标记物检测结果与亲本细胞株SW1990相比,耐药细胞株SW1990/ADM的倍增时间延长(P<0.05),G0/G1期比例增加,S期和G2/M期比例减少(P<0.05),但两株细胞间肿瘤标记物检测结果差异无显著性意义(P>0.05),见表1。2.3adm和mmc的耐药性MTT试验结果显示:与亲本细胞株SW1990相比,耐药细胞株SW1990/ADM对4种化疗药物均显示出一定的耐药性,尤以对ADM和MMC最为明显。其中对ADM的耐药指数高达49.60。细胞株对单纯化疗药物的IC50值见表2;Ver可以部分逆转其耐药性(见表2)。2.4耐药细胞系统的测定罗丹明外排实验结果显示,Ver阻断前,亲本细胞株SW1990和耐药细胞株SW1990/ADM的阳性细胞百分比分别为58.3%和11.1%,两组差异有显著性意义(P<0.01),表明耐药细胞株中P-gp的功能明显强于亲本细胞株;Ver阻断后可将阳性细胞百分比分别增加至83.3%和37.3%,明显高于阻断前的比例,说明Ver可以部分逆转耐药细胞株的P-gp功能。2.5物的光密度比值细胞株多药耐药基因表达的结果以mdr1mRNA与β-actin的RT-PCR产物的光密度比值来表示(见图2)。mdr1mRNA在SW1990和SW1990/ADM中的表达丰度分别为0.5750±0.0764和0.8921±0.0875(P<0.01),说明SW1990/ADM中mdr1mRNA表达明显增高。3讨论3.1胰腺p-gp表达Biedler等于1970年首先提出肿瘤多药耐药(MDR)这一概念,即肿瘤细胞对多种结构和功能不相关的化疗药物的交叉耐药现象。近30年的基础和临床研究表明,大多数肿瘤的耐药与多药耐药基因mdr1有关,其蛋白产物为P-gp,是一种细胞膜糖蛋白,具有能量依赖性药泵的功能,能将多种抗癌药物和其他疏水性化合物主动转运出细胞外,使细胞内药物浓度降低,最终导致细胞耐药。虽然人们曾对胰腺癌是否表达P-gp有争议,但近年来多数学者认为,胰腺癌存在内源性P-gp的表达,是一种先天性多药耐药肿瘤。Suwa等检测了71例未经化、放疗的胰腺导管腺癌组织标本中mdr1基因的表达情况,发现所有胰腺导管腺癌组织中均有mdr1基因的表达,且明显高于正常胰腺组织。我们的先期研究亦发现,胰腺癌细胞株有mdr1表达,且其表达程度互不相同;进一步研究发现,胰腺癌细胞株对ADM和MMC的耐药程度与多药耐药基因mdr1的表达成正相关性,且其耐药性可被P-gp特异性逆转剂Ver逆转。3.2药细胞株的制备方法Biedler等于70年代初首次通过体外化疗药物诱导建立了肿瘤多药耐药细胞株,为体外多药耐药机理研究提供了实验模型,初步揭示了肿瘤耐药机理。随后,人们利用多种不同的化疗药物体外诱导建立了多种肿瘤耐药细胞株,进一步加深了对其耐药机理的了解。肿瘤耐药细胞株建立的方法主要有基因转染法和药物筛选法。前者是将mdr1基因转染敏感细胞株,获得耐药细胞株,此种耐药表型的特点是耐药基因型单纯,但转染率不高,且在转染过程中容易因新基因的插入引起细胞性状的改变;后者是用化疗药物间歇或持续作用肿瘤细胞后得到具有MDR表型的细胞株,这种诱导方式比较类似于临床获得性耐药,是一种十分接近于肿瘤临床化疗后产生耐药的方法,对于探讨临床肿瘤化疗耐药机理更有意义。研究表明,肿瘤耐药细胞株诱导方式的不同可导致不同的耐药机理。国内、外绝大多数耐药细胞株的诱导方式与体内用药特点相差甚远。本研究考虑到临床胰腺癌化疗反复间歇用药的特点,以SW1990细胞为实验对象,采用大剂量反复间歇24h暴露法,历时10个月,获得了稳定生长、耐药指数较高的耐药细胞株,为研究胰腺癌耐药机理及筛选逆转剂提供了理想的实验模型。3.3耐药基因检测以往研究发现,与亲本细胞株比较,耐药细胞株在形态、结构及代谢水平等方面均发生了显著变化。本实验建立的耐药细胞株SW1990/ADM在无药培养2个月后生长稳定,倍增时间延长,细胞表面微绒毛增多,胞浆内出现大量空泡结构,我们推测这些生物学性状的改变与其耐药表型密切相关,但其详细机理尚有待进一步研究。