乳酸菌实验报告

乳酸菌的分离与培养保加利亚乳杆菌组长：王小员：王小英郑春玲阙小琴柳洁实验目的：1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。5.了解酸奶中乳酸菌分离原理,观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。实验器材：样品：含乳酸菌的酸奶培养基：改良MRS固体培养基蛋白胨5g牛肉膏5g酵母提取物2.5g柠檬酸二铵1g水500mL乙酸钠2.5gK2HPO41gMnSO4·4H2O0.125吐温800.5mL琼脂12.5gMgSO4·7H2O0.29gCaCO35g葡萄糖10g。仪器用品：500ml烧杯一个100ml量筒一个无菌培养皿12个250ml容量三角瓶2个5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只15ml试管7只高压灭菌锅天平水浴锅一个玻棒一根旋涡均匀器一台镜台测微尺电磁炉一个棉花纱布目镜测微尺牛皮纸麻绳接种环一个盖玻片酒精灯一盏牛角匙pH试纸血球计数板载玻片若干恒温培养箱酸度计擦镜纸、吸水纸液体石蜡显微镜载玻片玻片架、洗瓶、酒精灯火柴、滴管药品：结晶紫，乙醇，草酸铵，碘，碘化钾，番红，KOH，NaCl，10％NaOH，2%氯化铁。药品配制结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml95%乙醇中）20ml，1g草酸铵于蒸馏水100ml。将两液混匀即成卢戈氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取10ml与80ml蒸馏水混匀即可。

0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01%KOH100ml。混合A和B液即成，按1：100稀释即可。生理盐水：称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。实验步骤：培养基的培养1．称量用天平称取蛋白胨1g,牛肉膏1g,酵母提取物0.5g,柠檬酸二铵0.2g,乙酸钠0.5g,K2HPO40.2g,MnSO4·4H2O0.025g,MgSO4·7H2O0.06g,葡萄糖2g,2．溶解向上述烧杯中加入蒸馏水50mL无菌水，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热,在石棉网上加热溶解后,加入2.5g琼脂，并继续用微火加热。在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小，并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水至100mL。3．调节pH用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸测pH，直到pH到6.8左右。4．过滤要趁热用四层纱布过滤5．培养基的分装将培养基趁热分装到2个三角瓶里(一半为宜)。注意：分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。6．加棉塞培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内。7．包扎在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名二、灭菌1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平齐为宜（直至高水位灯亮起）。2．将扎好的试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。（注意：灭菌桶内的物品不能放得(4)复染滴加番红液，染色2—3分钟，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。(5)镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的乳酸菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。其中保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、或双杆菌或长丝状；嗜热链球菌，呈球状，成对、或短链、或长链状。十、保加利亚乳杆菌的细胞大小测定1、目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm2、菌体大小的测定取下镜台测微尺，将保加利亚乳杆菌染色标本片置于载物台上，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物。然后在高倍镜下转动目镜测微尺，测出保加利亚乳杆菌的长和宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位），测出的格数乘上目镜测微尺每格的长度，即等于该菌的大小。同法在油镜下转动目镜测微尺测出保加利亚乳杆菌的长和宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位），测出的格数乘上目镜测微尺每格的长度，即等于该菌的大小。例如目镜测微尺在显微镜下经过校正，当使用油镜时，每格相当于1.3μm。如果测量菌体的长度相当于目镜测微尺的两格，则菌体长度应为1.3μm×2=2.6μm。一般测定微生物细胞大小时，通常测量10—20个菌体左右，求出平均值，才能代表该菌的大小。用最大和最小的数值来表示菌体大小的范围。例如长为3~5μm，宽为1~2μm，则其大小为l~2×3~5μm。3、取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别再用擦镜纸擦拭后，放回盒内保存。（二）血球计数板在显微镜下直接计数保加利亚乳杆菌的数量如图--血球计数板构造上：俯视图（中间平台分为两半，各刻有一个方格网）下：侧面图（中间平台与盖玻片之间有高度为0.1mm的间隙）血球计数板通常是一块特制的厚载玻片，载玻片上有四条槽而构成三个平台（图5-2）。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽而隔成两半，每个半边上面各刻有一个方格网。每个方格网共分9大格其中间的1大格又称为计数室，微生物的计数就在此大格中进行。常用的血球计数板的计数室有两种规格的刻度网格。一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，即为16×25。另一种是一个大方格分成25个中方格而每个中方格又分成16个小方格，即25×16。但是不管计数室是哪种规格，其计数室的小格数总是相同的，即16×25=25×16=400（小格），见下图。图--计数网的区分与分格每一个大方格边长为lmm、则每一大方格面积为lmm2。盖上盖玻片后，载玻片计数室与盖被片之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3。在计数时，通常数5个中方格的总菌数，求得平均值。再乘上16或25就得一大方格中的总菌数。然后再换算成1mL菌液中的总菌数。（1mL=1cm3=1000mm3）操作步骤如下：1、取培养后的保加利亚乳杆菌液振荡混匀，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2）。稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰可数为宜。一般以每小格内含4～5个菌体的稀释度为宜。2.取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。3.将保加利亚乳杆菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4.静置5min后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数板的大方格网位置。寻找时光圈要缩小，光线要偏暗些，并将计数室移至视野中央。5．计数时用由16中格的计数板，要按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中格（即100小格）的保加利亚乳杆菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个格外，还需数中央l个中格的保加利亚乳杆菌菌数（即80个小格）。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。6．在高倍镜下计数：随机地计数5个中格内的菌数，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出1大格中的总菌数，最后再换算到每1mL菌液中的含菌数量。由于菌体细胞在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，故观察时必须不断调节微调节器，方能数到全部菌体以免遗漏。7.计算方法8.血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后，并用吸水纸吸水，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。十二、保加利亚乳杆菌的生理生化试验（1）乙酰甲基甲醇V-P实验接种新鲜的实验菌种于培养基中,40℃恒温箱中培养48小时后,取培养液1mL在其中加入1ml10％(2)糖发酵实验将表下表所示培养基成分(指示剂除外)称取、溶解、摇匀，调整pH值为6.8—7.0，添加1．6％溴甲酚紫指示剂，按l％的浓度添加试验糖类并溶解，分装试管，每管5mL，121℃蒸汽灭菌20min。室温冷却待用。接种供试菌液0．025ml，置37℃恒温培养l、3结果判定：阳性结果为培养基的颜色变黄，表示产酸；阴性结果为颜色不变(与不含糖类的对照管相同)或变蓝(紫)。糖发酵试验基础培养基组成培养基成分称取量蛋白胨5g牛肉膏5g酵母膏5g吐温80