sz诱导糖尿病大鼠模型的建立及病理观察

sz诱导糖尿病大鼠模型的建立及病理观察

糖尿病性肾衰竭（dkd）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是肾衰竭（esr）的主要原因。近年来的研究表明,DKD的发病率呈上升趋势,然而其发病机制至今仍未阐明。因此建立理想的DM实验动物模型是研究DKD发病及防治机制的重要手段。然而,在建立DM模型过程中常常因大鼠的高死亡率而导致成模率低。为此,本实验通过客观分析链脲佐菌素(STZ)诱导DM模型建立过程中存在的问题及注意事项,为造模率的提高提供借鉴。1材料和方法1.1许可证号、体质量、湿度清洁级雄性SD大鼠100只,8周龄,购自川北医学院实验动物中心,生产许可证号为SCXK(川)2008-1B,体质量(200±20)g。动物室温度控制在21~25℃,湿度控制在65%~69%。适应性饲养1周后进行实验,12h昼夜交替,自由进水进食,每笼5只,保持笼内清洁。1.2检测仪器及检测STZ(Sigma公司,美国)规格:1g/瓶(灭菌装),2~8℃保存,购自北京市博爱港商贸有限公司;苦味酸(2,4,6-三硝基酚,台山市众城化工有限公司);大鼠代谢笼(北京莱尔净化设备有限公司);血糖仪及血糖试纸(长沙三诺生物传感技术股份有限公司);高尔宝目测尿糖试纸(广州市花都高尔宝生物技术有限公司);肾之宝微量尿白蛋白(MAU)检测试剂盒(胶体金法)(上海凯创生物技术有限公司);肌酐试剂盒、尿素氮试剂盒、甘油三酯试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司);总胆固醇检测试剂盒(宁波瑞源生物科技有限公司);HITACHI全自动生化分析仪(日立仪器(苏州)有限公司):仪器型号:7600-010。全自动尿液干化学分析仪(日本京都),仪器型号:AX-4280。1.3实验计划1.3.1造模及检测结果雄性SD大鼠100只,随机分为两组,正常对照组(10只),实验组(90只)。适应性喂养1周后,造模前将大鼠禁食12h,将STZ用0.01mmol/L、pH为4.5的柠檬酸钠缓冲液配成1%的浓度,按65mg/kg体质量的剂量对实验组行一次性腹腔注射,正常对照组则用等量的柠檬酸盐缓冲液腹腔注射。DM造模标准:注射72h后检测空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG),FBG≥16.7mmol/L视为造模成功。根据造模标准,将实验组分为模型组以及未成模组。1.3.2般资料及分析方法整个实验共观察8周,实验结束前24h,将大鼠放入代谢笼中,收集各组大鼠尿液,记录尿量并送至我院检验科做尿常规检测。用10%的水合氯醛(3.5mL/kg)经腹腔注射麻醉大鼠后,经心脏采血,室温放置,2500r/min,离心10min,分离血清,检测肝功能、肾功能以及血脂。一般情况观察:观察各组大鼠的一般状况,如体质量、进食、饮水的量、小便的量,色以及气味等。血糖:采用血糖仪以及配套血糖试纸进行血糖监测,检测血糖前禁食8h,各组大鼠经剪尾尖放血法检测FPG。尿糖:采用尿糖试纸对尿糖水平进行半定量检测。尿蛋白:采用胶体金法,检测微量尿白蛋白(MAU)。肌酐、尿素氮:分别采用肌氨酸氧化酶法和紫外-谷氨酸脱氢酶法检测。白蛋白、总蛋白:分别采用溴甲酚绿法和双缩脲比色法检测。胆固醇、甘油三酯:分别采用酶比色法和甘油磷酸氧化酶法检测。KHI:大鼠处死后摘取左肾,用分析天平称重,计算肾脏肥大指数(KHI),KHI(‰)=肾质量(g)/体质量(g)×1000‰。1.3.3中性甲醛法死亡大鼠先进行大体解剖,后摘取左肾(称重后去除被膜)和肺脏,浸泡于10%(体积分数)中性甲醛溶液固定,作常规石蜡包埋组织块,5μm超薄切片,行HE染色,光镜下观察肾脏及肺脏的病理改变。1.4统计方法计量资料以ue0af±s表示,组间比较采用t检验;计数资料以率表示,采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1z诱导大鼠的喷洒行为实验过程中,正常对照组大鼠精神状态良好,动作自如,反应灵敏,毛色光滑;腹腔注射STZ诱导后,实验组大鼠毛色粗糙,精神萎靡,反应略迟钝,弓背弯曲。由表1可见,与正常对照组相比,实验组大鼠的进食量、尿量以及饮水量均增加,而且尿液出现泡沫增多的现象;与正常对照组相比,实验组大鼠的尿液酸臭味更加明显。但未成模组大鼠进食量、尿量及饮水量少于模型组。2.2未成对大鼠和未成模大鼠的死亡率比较整个实验过程中,正常对照组无大鼠死亡,模型组死亡25只(47.17%),未成模组死亡14只(37.83%)。与正常对照组相比,模型组大鼠以及未成模大鼠的死亡率均升高(P<0.05);而模型组大鼠的死亡率又高于未成模组(P<0.05)。2.3病理组织学检测实验组大鼠在注射STZ48h后开始出现大鼠的死亡,对死亡大鼠进行解剖。解剖时可见部分大鼠出现肺水肿,肺脏与胸廓广泛粘连,出现肺水肿的肺脏在病理上主要表现为肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞基底膜明显增厚,肺泡间隔增宽,间质中胶原和弹性蛋白含量增多,部分肺泡腔萎缩甚至塌陷,部分肺泡腔内有多量炎症细胞浸润,并可见片状坏死。肺水肿外观图片及病理见图1;部分大鼠出现肾脓肿,表现为肾脏与周围组织广泛粘连,表面凹凸不平,呈颗粒状,切开时发现肾脏上下极常存在单个或多个脓腔,内含乳白色液体,肾脓肿图片及病理详见图2。实验组大鼠因各种病因死亡的只数和死亡时间,见表2。2.4血糖及尿量水平与正常对照组相比,模型组以及未成模组的血糖以及尿量均升高(P<0.05);与未成模组大鼠相比,模型组大鼠的血糖以及尿量水平均升高(P<0.05)。在模型组中,与未死亡大鼠相比,死亡大鼠的血糖以及尿量水平更高(P<0.05);在未成模组,死亡大鼠与未死亡大鼠在血糖水平相当,前者尿量更高(P<0.05),见表3。2.5模型大鼠与未成组装大鼠的心肌尿素氮、khi水平的比较从表4可以看出,与正常对照组相比,模型组以及未成模组的体质量、模型组死亡大鼠的总蛋白、模型组以及未成模组的白蛋白、模型组以及未成模组死亡大鼠的胆固醇及甘油三酯水平较低,差异具有统计学意义(P<0.05);模型组以及未成模组的肌酐、尿素氮水平更高(P<0.05)。在模型组,与未死亡大鼠相比,死亡大鼠的体质量、总蛋白、白蛋白、胆固醇以及甘油三酯的水平更低(P<0.05)。肌酐、尿素氮以及KHI的水平更高(P<0.05);在未成模组,与未死亡大鼠相比,死亡大鼠的体质量、白蛋白、胆固醇以及甘油三酯的水平更低(P<0.05)。而肌酐、尿素氮以及KHI的水平更高(P<0.05);与未成模组中死亡大鼠相比,模型组中死亡大鼠的体质量、总蛋白以及白蛋白的水平更低,两者相比差异具有统计学意义(P<0.05)。与未成模组未死亡大鼠相比,模型组未死亡大鼠的体质量以及白蛋白水平更低,肌酐水平更高(P<0.05)。2.6不同大鼠尿常规的红细胞及红细胞的水平及培养率与正常对照组的尿常规相比,模型组及未成模组的红细胞、白细胞和感染率较高(P<0.05);无论是模型组还是未成模组,与未死亡大鼠相比,死亡大鼠尿常规中红细胞以及白细胞的水平及尿路感染率更高(P<0.05);在组间,与未成模组死亡大鼠以及未死亡大鼠的尿路感染率相比,模型组死亡大鼠以及未死亡大鼠的感染率更高(P<0.05),差异有统计学意义,见表4。3stz分次注射糖尿病模型DM实验性动物模型的造模方法有许多种,如化学药物诱导(主要指用STZ、四氧嘧啶诱导等)、胰腺切除、自发性模型以及转基因模型等。其中,STZ诱导模型是最常用的模型,该模型通过利用STZ的选择性毒性作用,导致胰岛β细胞损伤,从而造成胰岛素分泌不足,产生DM,而对其他脏器如肝肾等的损害很轻。虽然STZ和四氧嘧啶都是通过引起β细胞损伤而导致DM的发生,但是四氧嘧啶在破坏胰岛β细胞的同时,也可同时造成肝、肾等器官和组织的中毒性损害。因此,STZ诱发的DM动物模型常用于研究DKD。但是该方法动物的死亡率高,因此在建立模型时常存在较大的困难。本研究采用了经典的STZ诱导DM大鼠模型的制作方案,从实验结果看,我们的实验迅速地建立了1型DM模型,主要表现为血糖升高,尿糖阳性,尿蛋白阳性及多食、多饮、多尿以及体质量下降的现象。本实验的成模率为58.89%,较报道的成模率(60%~65%)略低,考虑可能与STZ的纯度、地域差别、环境条件、是否现配现用以及注射技巧等因素有关。王洪敏等研究发现,以20mg/kg体质量行单次腹腔注射STZ时,雄性SD大鼠均未成模,并且该组大鼠无死亡;STZ的剂量为30mg/kg时,大鼠的成模率为16.7%,死亡率为0;STZ的剂量为50mg/kg时,大鼠的成模率为91.7%,死亡率为0;然而,STZ的剂量为80mg/kg时,大鼠的成模率为58.3%,死亡率为33.4%。由此可以推断:血糖的变化与STZ剂量有关。剂量过低,不足以造成胰岛细胞的显著破坏引起高血糖,只有胰岛细胞大量损伤时才会导致糖尿病发生,而剂量过大,则会导致造模大鼠的急性死亡。DiLeo等采用60mg/kg的STZ单次腹腔注射剂量研究糖尿病大鼠模型,以血糖水平大于16mmol/L作为造模标准。研究发现大鼠饲料中补充牛磺酸可以降低大鼠的死亡率,同时发现较低的血糖水平与存活率的改善无相关性。由此可推断,血糖因素并非是引起DM大鼠死亡的主要因素。因此,对STZ注射诱导DM大鼠模型死亡的原因加以分析并防范具有一定的意义。本实验中观察到了大鼠体质量的显著下降,原因可能与以下几方面有关:(1)DM本身的高分解代谢状态;(2)DM模型大鼠由于本身的多饮多尿以及外源性水分补充不足等,共同造成机体的脱水状态;(3)STZ本身的毒性作用。本实验过程中,正常雄性SD大鼠无死亡。相对而言,模型组以及未模组的死亡率均显著升高,注射STZ后的大鼠在48h后开始出现死亡,1周内为死亡的高峰期,1~4周为死亡的集中期。针对死亡大鼠的解剖及病理结果,我们推测大鼠死亡的原因可能与以下几个方面有关:(1)感染。对注射STZ后1~4周的死亡大鼠进行解剖,我们发现部分大鼠存在明显的肺水肿以及肾脓肿的现象,病理结果进一步证实了感染的存在。我们的研究表明,无论是模型组还是未成模组,死亡大鼠与未死亡大鼠相比,具有体质量低、总蛋白和白蛋白及血脂低下的现象,由此我们推测,营养不良或许是大鼠易于感染的重要因素;另一方面,注射STZ后无论是模型组还是未模组大鼠,它们的抵抗力普遍降低,分析我们换垫料的次数,我们推测勤换垫料可能是导致肺部感染的一个重要诱因。因为垫料里面存在很多的碎屑以及粉末等,这些直径微小的粉末可能会通过呼吸道吸入肺内,造成肺部的感染。(2)营养不良。注射STZ后,我们发现无论是模型组还是未模组的大鼠,毛色较正常均会更加粗糙,无光泽。体质量下降明显,身体呈现弓背样弯曲,行走时四肢无力,精神欠佳。上述的变化估计与DM本身造成的高分解代谢有关,由于未成模组部分大鼠也会表现为体质量的下降,身体呈现弓背样弯曲的现象,因此我们推测注射STZ后严重干扰了机体的代谢平衡,从而造成营养不良。这与死亡大鼠的低体重、低蛋白血症、胆固醇以及血脂水平的降低相一致,同时也与鼠的高感染率相符合。(3)淋巴循环受阻。经过对注射STZ后死亡的大鼠进行解剖后,我们发现部分大鼠的肺脏以及肾脏与周围组织广泛粘连,病变器官较正常显著增大,而且将病变器官纵行切开后会发现病变器官存在多个脓腔,内含乳白色液体,疑似乳糜液,因此推测病变可能与淋巴循环受阻有关。(4)其他。对注射