乳酸杆菌肠道屏障的研究进展

乳酸杆菌肠道屏障的研究进展

肠道不仅是体内最大的消化部位，也是体内最大的免疫器官。这是防止肠道疾病入侵的第一个障碍。肠道屏障功能的好坏密切关系着动物的健康状态和抗病能力。随着抗生素在全球动物生产中的逐渐禁用,抗生素安全替代品在动物生产中得到了极大的推广,其中乳酸杆菌对肠道屏障功能的保护作用也受到越来越多的关注。1乳酸杆菌的养殖乳酸菌(lacticacidbacterial,LAB)是指能利用碳水化合物产生大量乳酸的一类细菌的总称。从形态上可分为杆状和球状两大类,通常为革兰氏阳性,接触酶阴性,细胞色素阳性,厌氧或兼性厌氧,不运动,无芽孢。乳酸杆菌属于乳杆菌科乳杆菌属,无鞭毛,无荚膜,微需氧或厌氧,能够分解糖类产生乳酸,具有较强的抗酸力,在pH3.0~4.5的酸性条件下仍能够生存。乳酸杆菌营养需要包括氨基酸、多肽、核苷酸、维生素、无机盐、脂肪酸和糖类等,最适pH为5~6,最适生长温度为30~40℃。乳酸杆菌不仅是动物肠道内存在的正常微生物,也是益生菌的重要组成部分。在畜禽健康的情况下,乳酸杆菌可以通过生物颉颃作用,改善肠道微生物的生态环境,增强肠道上皮细胞的屏障层及提高动物的免疫功能等机制而发挥益生菌的作用。中国农业部1999年第105号公告公布的允许使用的饲料级微生物添加剂仅有12种:干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、屎链球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母、沼泽红假单胞菌(张日俊,2007)。中国正式批准生产的制剂中,对乳酸杆菌含菌数量与用量的规定是:其数量不少于107个/g,每日添加与用量的规定是:其数量不少于107个/g,每日添加0.1~3.0g,一般添加量为0.02%~0.20%(张日俊,2007)。但是,乳酸杆菌的缺点是耐热性差,60~75℃条件下可被杀死,饲料制粒过程的瞬间高温即可将其杀死而失效。2对肠道屏障的认识肠道屏障是指肠道能防止肠腔内的有毒物质(如病原菌和毒素等)穿过肠黏膜进入体内其他组织器官和血液循环的结构和功能的总和。正常的肠道屏障包括免疫屏障和非免疫屏障两部分(Farhadi等,2003),其中免疫屏障主要指肠黏膜免疫系统,而非免疫屏障主要指肠黏膜屏障和微生物屏障。肠道屏障功能受损将导致肠道疾病的发生,如炎症性肠病、坏死性肠炎和食物过敏等(Farhadi等,2003)。目前,监测肠道屏障功能的方法主要有测定肠道通透性、紧密连接蛋白的表达情况、血浆内毒素(LPS)含量、血浆中二胺氧化酶含量、血浆D-乳糖含量、肠道细菌易位、肠黏膜免疫细胞数量和抗体水平、防御素和黏蛋白的分泌量,以及促炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6等)的水平等。2.1免疫调节作用肠道黏膜免疫系统是局部免疫系统的重要组成部分,它主要由肠相关淋巴组织(GALT)组成,包括组织化的淋巴组织和弥散型淋巴组织。其中组织化的淋巴组织是肠黏膜免疫系统的诱导位点和活化位点,主要负责摄取和转运抗原,包括PP结、M细胞、肠系膜淋巴结(MLN)和孤立淋巴滤泡等。PP结是肠道黏膜免疫的主要诱导部位,具有摄取抗原、启动免疫应答和调节IgA的产生等作用。M细胞是黏膜免疫的门户,其主要功能是抗原摄取。弥散型淋巴组织是肠道黏膜免疫系统的效应位点,传来的抗原在此被激活而产生抗体和各种免疫因子,主要指肠道黏膜固有层淋巴细胞(LPL)和上皮内淋巴细胞(IEL)。其中固有层是黏膜免疫应答的主要效应场所,参与免疫监视,对潜在的病原体作出积极的免疫应答反应,起到保护机体的作用,而IEL具有细胞杀伤和消除损伤上皮细胞的功能(Inagaki-Ohara等,2006),可调节细胞周转和完整性,是免疫屏障的重要组成部分(Sanz等,2009)。此外,分泌型IgA作为肠黏膜应答的主要效应因子,给黏膜表面提供特殊的免疫屏障,是阻止病原体入侵和定植黏膜的第一道防线(Corthesy,2007),在维持黏膜稳态中起着非常重要的作用(Cerutti,2008)。在正常生理状态下,肠道黏膜免疫系统处于大量抗原包围中,并依赖严格的识别机制(如Toll样受体通路等)来区分这些无害信号或危险信号(图1)。对于无害信号刺激(日粮成分和共生菌等),GALT保持免疫耐受或低反应性的免疫监视状态,以保障机体对营养物质的消化和吸收,维持肠黏膜的重要生理功能;对于危险信号(如病原菌等),GALT则及时反应将其清除,从而维持肠道稳定(Takahashi,2010)。2.2紧密连接蛋白肠黏膜物理屏障包括肠黏液层屏障和肠细胞屏障(图2)。肠道黏液层主要由肠道杯状细胞及肠上皮细胞分泌的黏液、浆细胞产生的分泌型IgA及黏液表面的大量水分组成的非搅动层组成(Farhadi等,2003)。肠黏液层屏障具有维持肠道的pH、阻止酸和蛋白酶及微生物对肠黏膜的侵蚀、润滑肠道黏膜免受机械损伤,还可为正常菌群提供适宜的生存环境等重要作用。肠细胞屏障主要由肠上皮细胞及其间的紧密连接蛋白构成,它可阻止一些大分子物质的进入,而且肠上皮细胞更新速度快,从而减少了病原微生物在肠道内的定居。肠上皮细胞层主要由肠上皮细胞(占90%~95%)、分泌黏液的杯状细胞、肠道内分泌细胞和分泌抗菌肽的潘氏细胞组成(Sanz等,2009)。紧密连接是相邻上皮细胞间隙的松散连接,位于相邻上皮细胞、间皮和内皮之间,多呈带状分布,少数为点状,起着封闭细胞间隙的作用,可防止肠腔内物质自由经过细胞间隙(吴国豪,2004)。紧密连接对于维持选择渗透性屏障功能非常关键,它通过调节限制穿过组织的离子与蛋白的运动,在细胞层间形成化学与离子梯度,从而有助于进行载体转运过程(马怡然等,2010)。正常情况下,紧密连接通过调控作用,选择性地转运相应物质,而有效地阻止肠腔内细菌、毒素及炎性介质等物质的旁细胞转运,维持肠黏膜上皮屏障功能的完整(Nusrat等,2000)。紧密连接蛋白结构见图3。目前,已知组成紧密连接的蛋白质包括跨膜蛋白(封闭蛋白occludin、闭合蛋白claudins)、JAM及胞质分子ZO-1、ZO-2、ZO-3、cingulin、7H6、rab3B、rab13、symplekin、AF-6等(Bazzoni等,2000)。跨膜蛋白与胞质分子的结构完整性及其之间的相互作用调节着紧密连接的屏障功能。2.3细菌和真菌生长肠道微生物是肠道微生态环境的重要组成部分。肠道免疫力的发育与肠道菌群密切相关(Blaschitz等,2010)。正常的肠道微生态群系是以肠道专性厌氧菌(如类杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等)为优势菌的肠道菌群,它对病原菌的入侵起着屏障作用,并能协助动物产生免疫反应。双歧杆菌或厌氧乳杆菌主要定植于肠道黏膜深层,类杆菌、消化链球菌和优杆菌定植在中层,表层定植需氧的大肠杆菌和肠球菌。动物体对致病菌或潜在致病菌定植和繁殖的抵抗力受宿主和肠道微生态群系的双重影响,尤以正常菌群的影响最为重要。正常菌群作为自然生物屏障,是阻断病原微生物定植和感染动物的关键步骤。肠道微生物区系的平衡对肠黏膜免疫系统的健康发展有重要作用。当肠道微生态发生失衡时,肠道抵御病原体的能力下降,主要表现为腹泻、消化不良、肠炎等一系列肠道疾病。3蘑菇对肠道屏障的调节效果3.1细菌含zo益生大肠杆菌1917能够上调小鼠IEC中ZO-1的表达量,从而防止DSS肠炎引起的黏膜通透性的增大,抑制肠腔抗原的进入(Ukena等,2007)。干酪乳杆菌增强了上皮通透性,增加了ZO-1的表达量,从而抑制了细胞因子TNF-α和IFN-γ诱导的IEC上皮屏障功能损伤,这可能是与MAPK信号通路和TLR2-PI3K/Akt通路有关(Eun等,2011)。乳酸菌对失血性休克小鼠肠道完整性的影响具有菌株特异性,其中鼠李糖乳杆菌显著降低了小鼠的血浆内毒素水平、细菌易位情况及F-actin的分布,而植物乳杆菌对肠道完整性无显著影响,但它们的DNA均能抑制由内毒素引起的TNF-α释放,减轻肠炎症状(Luyer等,2005)。3.2菌rtec-1黏附于结肠的皮细胞早期研究结果表明,从兔的结肠黏膜中分离得到的黏蛋白可以抑制病原性大肠杆菌RDEC-1黏附于体外培养的结肠上皮细胞上(Mack等,1991)。植物乳杆菌299v和鼠李糖乳杆菌LGG可能通过提高肠黏蛋白MUC2和MUC3的表达,从而抑制病原菌黏附在肠上皮细胞上(Mack等,1999)。3.3植物乳杆菌对claudin3表达的调控体内和体外的试验结果表明,益生菌VSL#3通过激活p38和ERK信号通路,提高了肠道紧密连接蛋白的mRNA表达量,从而保护肠道上皮屏障(Dai等,2012)。植物乳杆菌MB452显著提高了体外培养的Caco-2细胞中19个与紧密连接蛋白相关的基因表达量,同时免疫荧光结果显示植物乳杆菌处理10h后,Caco-2细胞的occludin、ZO-1、ZO-2和cingulin的荧光强度显著高于对照组(Anderson等,2010)。鼠李糖乳杆菌LGG活菌或灭活菌均能诱导Claudin3表达上调,促进肠道屏障的成熟(Patel等,2011)。LGG降低了大肠杆菌O157∶H7感染导致的细胞形态变化、电阻力升高和肠道通透性减少,促进紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的重建(Johnson-Henry等,2008)。鼠李糖OLL2838抑制了TNF-α诱导的Caco-2细胞屏障损伤和IL-8分泌,且口服鼠李糖OLL2838活菌或灭活菌均能重建肠道屏障功能,这可能与肠上皮细胞的ZO-1及肌球蛋白轻链激酶的表达上升有关(Miyauchi等,2009)。3.4促进肠粘膜的免疫功能3.5抗炎性生物因子热灭活短乳杆菌SBC8803能够刺激热应激蛋白和p38MAPK磷酸化,调节TNF-α、IL-1β和IL-12的蛋白表达量,增强氧化应激条件下的肠上皮屏障功能,维持肠道稳态,减轻肠道炎症(Ueno等,2011)。LGG可能通过部分抑制NF-κB信号通路,减少促炎性细胞因子对肠上皮屏障完整性和肠道炎症的影响(Donato等,2010)。嗜酸乳杆菌L-92能同时提高Th1和Th2细胞因子反应,诱导PP结产生TGF-β(Torii等,2007)。干酪乳杆菌亚种鼠李糖Lcr35处理48h后,显著抑制了LPS诱导的Caco-2/PBMC(人外周血单核细胞)共培养体系中IL-8的含量,下调了单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的mRNA表达量,提高了电阻力,说明Lcr35在体外具有抗炎性作用,能够改善沙门氏菌LPS诱导的肠道上皮炎症引起的屏障损伤(Fang等,2010)。研究结果发现,干酪乳杆菌显著减少了黏膜损伤面积、髓过氧化物酶(MPO)活性和细菌易位,改善了三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的黏膜损伤、炎症反应和屏障损伤(Llopis等,2005)。3.6鸡空肠大肠杆菌数、增加空肠乳酸杆菌数及大肠杆菌和乳酸杆菌比例在日粮中添加0.5%嗜酸乳杆菌(含菌量9×1010个/mL)显著降低了肉仔鸡空肠大肠杆菌数、增加空肠乳酸杆菌数及大肠杆菌和乳酸杆菌的比例(陈丽艳,2006)。食入的益生菌可能通过提高黏蛋白的表达,减少细菌过度生长,刺激黏膜免疫和合成抗氧化物质来增强黏膜屏障功能(Gotteland等,2001)。4乳酸杆菌制剂综上所述,肠黏膜屏障、肠道免疫系统构成的免疫屏障及肠道菌群构成的生物屏障是肠道屏障的3大重要组成部分。随着饲用抗生素的禁用后,乳酸杆菌制剂的研究和应用将是大势所趋。许多研究结果表明,乳酸杆菌制剂对肠道屏障功能具有保护作用,能够修复肠道炎症和应激状态下引起的屏障功能损伤。但是目前乳酸杆菌制剂的应用存在一些问题,如菌株特异性、生产工艺对其应用效果的影响、发挥最佳效应的添加方式和剂量、与益生元或其他添加剂的配伍问题等,仍有待进一步的研究。卷曲乳杆菌KT-11显著提高了C3H/He