宫颈癌组织凋亡相关蛋白survilin、fas、fasl表达与临床病理对照研究

宫颈癌组织凋亡相关蛋白survilin、fas、fasl表达与临床病理对照研究

死亡不仅在正常的生理调整中起着重要作用，而且在恶意病变的过程中也起着重要作用。细胞凋亡过程受凋亡抑制基因与凋亡活化基因的共同调节。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein,IAP)的家族成员,具有明确的抗凋亡作用。Fas是促进细胞凋亡的信号分子。Fas/FasL属于TNF/NGF受体家族,FasL与Fas的交联及信号转导在诱发细胞凋亡、维持机体自身稳定和保持内环境平衡等方面起着重要的作用。Fas与自然存在的FasL结合将启动凋亡信号,导致Fas阳性细胞在数小时内凋亡。Survivin与Fas共同作用于在凋亡通路中发挥决定作用的Caspase3和Caspase7。本研究拟观察Survivin和Fas/FasL系统在正常宫颈、慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)和宫颈癌中的表达及其在宫颈癌发生、发展过程中的临床意义。1数据和方法1.1患者年龄分布宫颈组织标本取自上海交通大学附属第一人民医院妇产科2001年1月—2008年12月行子宫手术或宫颈活检者,标本均经病理科医师复阅HE染色切片证实;其中宫颈癌47例,CIN25例,慢性宫颈炎20例,正常宫颈组织标本20例。47例宫颈癌患者的年龄为25～52岁,中位年龄38岁;鳞癌42例,腺癌5例;按分化程度为高分化15例,中分化29例,低分化或未分化3例;临床分期(FIGO,2000)为Ⅰa期5例,Ⅰb～Ⅱa期39例,Ⅱb～Ⅲ期3例;有淋巴结转移30例,未转移17例(完成手术者经病理检查诊断,未手术者根据MRI诊断)。所有患者术前均无放疗和化疗史。20例CIN患者的年龄为25～49岁,中位年龄37岁;CINⅠ级9例,CINⅡ级11例,CINⅢ级5例。20例慢性宫颈炎患者的年龄为30～55岁,中位年龄42岁。20例正常宫颈者的年龄为25～51岁,中位年龄38岁。各组间年龄分布差异无统计学意义(P>0.05)。1.2实验试剂与方法宫颈组织标本做4μm连续切片,行免疫组织化学染色(SP法)。一抗Survivin兔抗人多克隆抗体、Fas兔抗人多克隆抗体、FasL兔抗人多克隆抗体均为美国SantaCruz公司产品;通用型免疫组织化学试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。一抗工作浓度均为1∶100。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。石蜡切片脱蜡,以微波枸橼酸盐进行抗原修复,DAB显色,苏木精复染,脱水、透明、封片,光学显微镜下观察。用已知的阳性乳腺癌切片作为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。1.3半定量分析结果切片经病理科医师证实有抗原表达及定位,Survivin、Fas和FasL均以出现棕黄色颗粒为阳性细胞。高倍镜(×400)下综合细胞染色强度和阳性细胞计数进行半定量分析。染色强度评分标准:不着色为0分,黄色为1分,棕黄色为2分,黄褐色为3分。每张切片随机观察5个视野,计数500个细胞中阳性细胞所占比例进行评分,评分标准:阳性细胞<10%者为0分,10%～40%者为1分,40%～70%者为2分,≥70%者为3分。两项评分相加,0～1分为(-),2分为(+),3～4分为(++),5～6分为(+++);其中(-)为阴性,(+～+++)为阳性。1.4计数资料比较及相关分析采用SPSS16.0统计软件包进行统计分析。计数资料比较采用χ2检验和Fisher精确概率法;相关分析采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1正常乳房组织、慢性宫颈炎组织和cin组织的表达差异Survivin阳性细胞定位于细胞质内(图1);Fas和FasL主要定位于细胞质和细胞膜(图2、3)。不同宫颈组织中Survivin、Fas和FasL的表达见表1。Survivin和FasL在宫颈癌组织中的阳性表达率高于正常宫颈组织、慢性宫颈炎组织和CIN组织,差异均有统计学意义(P<0.05);且两者在正常宫颈组织中均不表达。Survivin在CIN组织中的阳性表达率与慢性宫颈炎组织相比差异无统计学意义(P>0.05),与正常宫颈组织比较差异有统计学意义(P<0.05);但Survivin在慢性宫颈炎组织和正常宫颈组织中的阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。FasL在CIN组织与慢性宫颈炎组织的阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05),但均明显高于正常宫颈组织(P<0.05)。Fas在宫颈癌组织中阳性表达率均低于正常宫颈组织、慢性宫颈炎组织和CIN组织(P<0.05);但正常宫颈组织、慢性宫颈炎组织和CIN组织间的阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。2.2asl阳性表达率及与fas表达的关系采用Fisher精确概率法分析47例宫颈癌患者Survivin、Fas和FasL的表达(表2)。其中,在<35岁患者与≥35岁患者间,Survivin、Fas和FasL阳性表达率的差异无统计学意义(P>0.05)。Survivin的表达与宫颈癌临床分期、是否有淋巴结转移有关(P=0.043,P=0.008),与病理分级、组织类型、肿瘤生长类型无明显关系(P>0.05)。Fas的表达与宫颈癌临床分期、病理分级、组织类型、肿瘤生长类型、是否有淋巴结转移均无明显关系(P>0.05)。FasL的表达与宫颈癌临床分期、病理分级、是否有淋巴结转移有关(P=0.034,P=0.049,P=0.042),但与组织类型和肿瘤生长类型无明显关系(P>0.05)。2.2fas表达在Survivin表达阳性的32例宫颈癌组织中,10例Fas表达阳性,32例FasL表达阳性;在Survivin表达阴性的15例宫颈癌组织中,13例Fas表达阳性,12例FasL表达阳性;Survivin与Fas的表达呈负相关(r=-0.517,P<0.01),与FasL的表达呈正相关(r=0.381,P<0.01)。在FasL表达阳性的44例宫颈癌组织中,21例Fas表达阳性;在FasL表达阴性的3例宫颈癌组织中,2例Fas表达阳性;FasL与Fas的表达相关性不显著(r=-0.093,P>0.05)。3不同病理组织学检测faol表达在正常提高和fas阳性表达率中的作用Survivin是IAP家族中最小的成员,它由定位在人染色体17q25位点的单拷贝基因编码,是含有142个氨基酸、相对分子质量为16500的蛋白,具有抑制凋亡和调节细胞分裂的作用。Survivin在大多数终末分化组织中缺失或低表达,而在大多数人实质性肿瘤和血液恶性肿瘤中强表达,与肿瘤的发病、侵润及预后密切相关。本研究结果提示Survivin表达与宫颈癌临床分期和淋巴结转移有关,与上述结论一致,提示Survivin作为一个肿瘤特异性因子,在宫颈癌预测患病危险度中有应用价值。Survivin主要通过以下两种途径抑制凋亡:第一,Survivin可通过细胞周期依赖激酶(cyclin-dependentkinase,CDK)调节凋亡,通过促进CDK4释放p21而抑制凋亡;第二,Survivin可与激活的Caspase3和Caspase7结合,阻止由Caspase激活剂或凋亡诱导剂诱导的细胞DEVD-cleaving自杀酶的累积;而Caspase3是Fas介导的细胞凋亡的重要通路,Survivin/CDK4复合物形成后引起p21释放,并与线粒体内的Caspase3相互作用而抑制由Fas介导的细胞凋亡。然而有报道显示,Survivin抑制激活Caspase9,并不抑制激活的Caspase3和Caspase7,这可能可以解释本实验中为何Survivin与Fas的结果并不一致。Fas是一种由定位于人染色体10q23的Fas基因编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白,相对分子质量为45000,在细胞凋亡中起调节作用。FasL是肿瘤坏死因子家族的一种Ⅱ型跨膜蛋白,定位在人染色体1q23,相对分子质量为40000,它与其受体结合介导凋亡。FasL/受体的相互作用在免疫系统调节和肿瘤进展中起到重要作用。近年来研究发现,许多肿瘤细胞通过其表面Fas和FasL,不但能有效逃避机体淋巴细胞的攻击,而且还能主动杀死与之接触的免疫活性细胞,导致免疫治疗失败。本研究发现,FasL在正常宫颈组织、慢性宫颈炎组织、CIN组织和宫颈癌组织中呈现的表达逐级升高且差异有统计学意义,尤其是在慢性宫颈炎细胞中的表达相比正常细胞升高,提示FasL能有效促进细胞逃避淋巴细胞的攻击,足以解释经久未愈的慢性宫颈炎患者容易罹患CIN和宫颈癌的临床现象,验证了慢性炎症在宫颈癌发生和发展中的作用。目前公认宫颈癌的发生、发展是由宫颈不典型增生(轻→中→重)→原位癌→早期浸润癌→浸润癌的连续发展过程,因此与国内其他研究不同的是本研究比较了Survivin、Fas、FasL在正常组织、慢性宫颈炎组织、CIN组织和宫颈癌组织中的表达差异,按宫颈癌发生、发展的连续过程比较3个指标的表达差异。本研究发现,Fas在宫颈癌阳性表达率远低于正常宫颈组织,提示在宫颈癌的发生中可能存在Fas抗原缺失,这可能是宫颈癌发病机制之一。宫颈癌组织中FasL表达阳性率与宫颈癌的临床分期、病理分级、淋巴结转移有关,提示宫颈癌组织中FasL表达阳性率的高低可以反映病变恶性程度及病程进展。本研究结果还显示,FasL在宫颈癌及在CIN中的阳性表达率明显高于正常宫颈组织,提示宫颈癌的发生与FasL表达上调有关;表明肿瘤细胞表达FasL,并可以通过促进体内Fas阳性的淋巴细胞凋亡逃避机体的免疫监视。FasL在慢性宫颈炎、宫颈CIN、宫颈癌组织中阳性表达率逐步升高以及在宫颈CIN组织中的高表达提示,FasL的影响出现于病变进程的早期,当FasL表达不能下调时通过抑制宿主的免疫系统,CIN将发展为浸润癌,与目前公认的宫颈癌发生、发展的连续过程一致且密切相关。本研究还发现,FasL表达与宫颈癌的临床分期、病理分级有关,有淋巴结转移者FasL阳性表达率明显高于无淋巴结转移者,提示FasL高表达者预后较差;更为重要的是FasL还与病变进程密切相关,而Survivin表达仅与临床分期和淋巴结转移有关,提示FasL可作为宫颈癌患者病程进展和预后的预测指标之一。Fas/FasL系统的生理功能在于通过对细胞凋亡的调节,限制某些细胞群落的过度膨胀或萎缩,参与正常细胞增殖、分化和凋亡动态平衡的维持,在临床多种疾病的发生过程中具有重要的作用。Fas作为一种普遍表达的受体分子,可出现于多种细胞表面;但FasL的表达却有其特点,通常只出现于活化的T细胞和NK细胞,因而已被活化的杀伤性免疫细胞往往能够最有效地以凋亡途径杀死靶细胞。研究发现,大多数良性肿瘤Fas的表达类似于其来源的正常组织,而恶性肿瘤的Fas表达明显下调或缺失,逃避体内Fas/FasL系统对其的清除作用。本研究对上述3个指标的相关性分析发现,Survivin与Fas/FasL系统的表达有相关性,这与上述Survivin抵制凋亡的机