糖尿病肾病大鼠肾脏和肺脏水通道蛋白-2、肺脏水通道蛋白-1的表达

糖尿病肾病大鼠肾脏和肺脏水通道蛋白-2、肺脏水通道蛋白-1的表达

糖尿病性肾衰竭（dn）是糖尿病最常见的微血管并发症，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。已往对DM肾、肺的微血管并发症研究相对较少。实验观察,水液代谢紊乱是DM肺、肾损伤的一个独立的因素;研究表明,水通道蛋白家族(AQPs)在DM及其微血管并发症发生发展中起重要作用。本研究观察DM肾、肺组织微血管的病理学改变,及其水通道蛋白-2(AQP2)、水通道蛋白-1(AQP1)表达及丹参干预AQP2、AQP1的效应变化,旨在探讨AQP2、AQP1的表达改变与糖尿病肾病水液代谢异常的关系以及丹参的药理效应,为DN的预防和提供依据。1材料和机器1.1动物1.2药物和试剂1.3仪器2方法2.1动物组和糖尿病模型的构建和药物2.2细胞法检测rabcisanti-aqp2的表达肾组织免疫组织化学染色(试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司)。按试剂盒操作步骤进行加样,以SABC法进行检测。一抗为Rabbitanti-AQP2。细胞浆中呈现棕黄色颗粒为阳性反应,图像采用Miaspro图像分析系统进行分析。所有切片放大倍数为1000×。每组取6只动物,每只动物AQP2染色各取2张切片,观察3个视野。视场面积为480000mm2,测定阳性面积比[Aa(%)](阳性面积/视野面积)。2.5统计处理3结果3.1各组动物的一般情况3.2各组动物肾组织病理学改变3.3肺组织的病理改变3.4肾组织3.5肺组织4降血糖对大鼠肝肾功能的影响AQP的发现为糖尿病肾病水代谢的异常提供了新的研究角度。肺泡腔和血管腔间水的快速转运有极其重要的生理功能。肺泡内水转运主要有两条途径:一是伴随钠的主动转运;二是经肺泡上皮上的AQPs。AQP1主要表达于肺泡周围的毛细血管内皮细胞,调节肺内毛细血管与肺泡间水通透性。具体机制:(1)通道管的空间尺寸限制了比水分子大的小分子的通过;(2)通道管的溶质结合位置分布使水分子得以顺利通过;(3)通道管有限度的亲水环境阻碍水溶液中离子的通过。有资料显示AQP1基因敲除小鼠与野生型相比,肺渗透压依赖的被动性水转运被抑制90%。尿液浓缩稀释功能由肾脏集合管主细胞的AQP2来完成,而AQP2的表达主要受加压素(anti-diuretichormonevasopressin,AVP)的调节。AVP与肾组织集合管主细胞基底膜上的AVPV2受体结合后,使细胞内cAMP浓度升高,激活PKA,将AQP2蛋白磷酸化,使之从囊泡穿梭到管腔膜,从而提高集合管对水的通透性,同时该信号通路激活CREB元件,刺激AQP2的合成,表现为AQP2mRNA和蛋白水平的提高,从而实现AVP的抗利尿作用。既往研究表明在DM大鼠中血AVP水平升高,这可能与水钠潴留有关,而AVP升高除了受非渗透性因素的影响外,血浆晶体渗透压的相对升高也是促进下丘脑合成和分泌AVP的因素之一。祖国医学认为肺肾之间在水液代谢方面关系密切。在生理情况下,肺主气,体内的水液经过肺气的宣肃,才能输布到全身各脏腑组织器官,并下达到膀胱,所以,肺被称作“水之上源”。若肺的通调水道功能减退,就可发生水液停聚而生痰、成饮,甚则水肿,无汗等病变。肾为水脏,职司气化,水夜的升降开合,全要靠肾的气化作用。肺肾合作,才能保证水液代谢正常的完成,两者中,肾又占主要地位,故《素问·水热穴论》说:“其本在肾,其未在肺”。在病理方面:肺失宣肃,通调水道的功能失调,能累及到肾,出现小便不利,甚至水肿;肾虚水无所主,逆而上泛,又会见到喘咳气急,不得平卧。祖国医学所认识的消渴,日久则出现的“水肿”“胀满”“尿浊”“关格”与现代医学的糖尿病肾病的临床症状相似。《金匮要略》有记载“血不利则为水”,丹参可以通过扩张血管、加快血液流速,从而消除血液淤滞改善微循环,因此“血行则水行”,局部的水肿状态得以改善。丹参之脂溶性成分丹参酮,水溶性成分丹参素、原儿茶醛、丹参酚酸B,研究证实丹参增加肾血流、有利尿和抗炎作用,可降低血BUN、Scr,调节肾组织局部微循环,改善肾功能。本研究结果表明丹参能显著降低糖尿病大鼠24h尿蛋白排泄率、血糖,改善“三多一少”症状。而单纯用降糖药物(格列吡嗪)仅能降低血糖,但对改善DN状态下的肾脏血流动力学效果不佳。丹参不仅可降低血糖而且还能全面调理DN状态时的血液流变学情况,延缓肾小球硬化的发生,减少细胞外基质,从而对糖尿病肾病起到保护的作用。同时我们又发现用丹参治疗能显著降低糖尿病大鼠肾组织中的AQP2蛋白表达,提高AQP1在肺脏的表达,因此我们推测丹参对糖尿病大鼠肾脏的保护作用可能与降低AQP2,导致AQP2在肾脏集合管重新分布有关,升高AQP1的表达改变微血管通透性,以减轻DM病变脏器的水肿病理状态。本研究从蛋白水平探讨了中医的肺肾同治理论,有关丹参改善水液代谢作用机理与水通道蛋白的关系,有待进一步深入研究。选用4周龄雄性SPF级SD大鼠[第四军医大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(军)2002-005]60只,体质量为(165±12.5)g。SPF级饲养环境,环境温度为20~25℃,12/12h昼夜规律,按每笼5只喂养。格列吡嗪片(5mg/片),海南赞邦制药有限公司,批号051207;丹参(西京医院药剂科中药制剂室煎制):按成人剂量的10倍,水煎浓缩至稠膏每克含生药5.1g,按5.5g/kg(体质量),1次/d,灌胃,4℃冰箱贮藏备用。链脲佐菌素(Strep-美国公司)。GeneAMPPCRsystem2400(AppliedBiosystems);微量血糖测定仪,美国罗氏公司生产;UV-2501PC型分光光度计,日本岛津仪器厂生产;Miaspro图像分析系统。2.4动物分组、治疗组及高糖高糖模型的建立与管理随机将大鼠分为两组:正常组10只;糖尿病造模组(DM)50只;正常组进食普通饲料。糖尿病造模组进食高糖高脂饲料,即普通饲料中加入10%的猪油、10%的葡萄糖、1%的胆固醇、2%的蛋黄粉、0.2%的胆酸钠。糖尿病模型组大鼠在高糖高脂饲料喂养4周后尾静脉注射低剂量STZ(30mg/kg)1次。以注射后1个月血糖值持续高于7.8mmol/L,尿糖阳性者为DM模型建立成功(成模率为60%),共选出糖尿病动物30只,随机分到模型组,对照组和观察组3个组中,每组10只。该模型具有中度高血糖、高血脂、胰岛素抵抗以及典型的糖尿病肾病改变等特点。对照组:每日灌服格列吡嗪5mg/(kg·d),观察组:每日灌服丹参5.5g/(kg·d)。正常组和模型组灌服等体积的蒸馏水。实验期间,所有动物在同一条件下,室温保持在20~24℃,相对湿度40%。正常组动物自由饮水,标准饮食,模型组、治疗组、观察组动物给予高糖高脂饮食,自由饮水。至第16周末,用25%乌拉坦麻醉大鼠,打开腹腔,从腹主动脉取血,充分暴露两侧肾脏,将分离的肾脏迅速放入4%多聚甲醛中固定,用于石蜡切片。开胸充分暴露手术视野,分离肺组织,将肺组织迅速放入装有4%甲醛的瓶中固定右肺中、下叶做病理学观察,左肺做免疫组化染色。2.3正常大鼠肾组织病理学观察肺组织免疫组织化学染色(试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司)。按试剂盒操作步骤进行加样,以SABC法进行检测。一抗为Rabbitanti-AQP1。肺泡间质中微血管呈现棕黄色为阳性,所有切片放大倍数为400倍每组随机取6只动物,每只动物AQP1染色各取3张切片,各观察3个视野,视野面积为480000mm2,免疫组化结果以单个视野下阳性微血管数表示。SPSS10.0统计软件进行分析,采用One-wayANOVA法进行方差分析。两两比较时根据其方差是否齐性选择LSD或DunnettC方法。实验数据以x±s表示。正常组大鼠体质量稳定增长,皮毛光泽,一般情况好;模型组大鼠均出现多饮、多食、多尿,早期体重不同程度的有所增加,8周后一般情况变差,体重下降,消瘦,毛发失去光泽,后期出现腹胀。对照组和观察组动物的一般情况较好,体重比较稳定,“三多一少”症状较模型组明显减轻,皮毛较为光泽,没有观察到腹胀。血糖和24h尿蛋白排泄率也较模型组明显降低。结果见表1。正常组大鼠肾小球结构清晰,肾小管上皮细胞排列整齐,基底膜完整,间质中未见炎症细胞浸润、纤维组织增生;模型组肾小球明显肥大,系膜区增宽,系膜细胞增生、基质增多,血管壁增厚,球内可见大量红细胞淤积,肾小管上皮细胞弥漫性空泡状变性、肿胀脱落,部分肾小管内有蛋白管型淤积;对照组上皮细胞空泡状变性呈片状,肾小球内可见红细胞淤积的情况,肾小管偶见上皮细胞脱落,小管内可见蛋白管型;观察组上皮细胞空泡状变性呈局灶状,仅存在于肾被膜下,肾小球内少见红细胞淤积,肾小管未见上皮细胞脱落,小管内少见蛋白管型。结果见图1~4。正常组动物肺体积适中,颜色淡红,无充血现象;模型组动物肺体积增大,渗出明显,肺缘钝圆,切面质实,包膜下有点、片状出血;观察组和对照组动物较模型组上述病变减轻。镜下观察,正常组动物肺组织肺泡无萎陷,肺泡壁无增厚,肺泡间隔无增宽,肺泡和肺间质无炎细胞浸润(图5);模型组动物见肺泡腔缩小,肺泡数量增多,肺泡隔明显增宽,成纤维细胞数量增加,毛细血管基底膜增厚,血管扩张淤血,腔内充满红细胞,有较多中性粒细胞浸润(图6);观察组和对照组动物肺组织上述改变减轻(见图7~8)。AQP2的蛋白表达结果显示,AQP2蛋白在肾集合管表达,而在肾小球和肾间质未见表达,与以往报道一致。模型组大鼠肾脏AQP2蛋白沿集合管内壁上皮细胞分布的棕黄色颗粒比正常组明显颜色加深而浓厚,分布面积更广泛。上述结果说明模型组大鼠肾脏AQP2在蛋白水平上表达增强;对照组和观察组AQP2的棕黄色比模型组明显色度减轻,面积减少(P<0.05)。见表1。QP1的蛋白表达肺组织中肺泡周围和支气管周AQP1