农业生物技术重要知识点梳理汇总

〔〕农业生物技术重要学问点梳理汇总农业生物技术精要第一章绪论1•农业生物技术的概念：生物技术又称生物工程，它是承受高科技手段对生物性状进展改进，培育高产、优质、抗逆品种或利用生物体生产有价值的产品的技术。应用于农业领域的生物技术即农业生物技术。2.生物技术诞生的标志：DNA重组技术、淋巴细胞杂交瘤技术3•现代生物技术起始时间：2070年月农业生物技术的内容：-基因工程细胞工程酶工程.一发酵工程1983年，第一株转基因植物问世。1981年，首次获得转基因小鼠。其次章植物组织与细胞培育1.植物组织与细胞培育的理论根底是“单个生活的植物细胞具有全能性”第三章细胞工程与植物性状改进无第四章 植物基因工程根本原理基因的构造q増强子「编码蛋白的基因＜

i沉默子

〔大局部〕 i终止信号区编码RNA 的基因1(》农业生物技术重要学问点梳理汇总(》农业生物技术重要学问点梳理汇总多基因家族：起源于单基因，在植物进化中，通过基因的复制及放大而成为多基因家族，同一家族的基因成员具有高度的同源性。比方编码储存蛋白的基因、豆血红蛋白的基因等。病毒启动子一CaMV35SProo(花椰菜花叶病毒(CaMV)是一种双链DNA病毒)CaMV35SPromoter特点:不同于正常构造基因的启动子，可启动整个CaMV基因组(约8000bp)RNA。启动作用较强，可在大多数植物细胞内启动基因的表达，并受植物细胞的调控。组成型表达。启动子依据作用方式及功能可分为三类：”■花椰菜花叶病毒(CJIMV)35S启动子-组成型启动子-水稻肌动蛋白启动子Lubi启动子rPNZIP基因启动子一叶片启PP2基因启动子一韧皮部prolin2基因启动子一维管束_白藜芦醇合酶基因Vstl启动子一病虫侵害、诱导型启动子・UV照耀、臭氧环境或化学物质S82b基因启动子——SA2

转录水平基因沉默(TGS)■转录后基因沉默(PTGS)cDNA文库：以mRNA为模板经反转录合成的DNA文库，代表了大多mRNA的信息，其制备过程包括样品总RNA的分别，cDNA的合成，cDNA插入载体DNA分子，以及转化细菌生殖保存等步3(》农业生物技术重要学问点梳理汇总骤。DNA为材料制备的文库，代表整个基因组的DNA信息。其制备过程包括基因组DNADNADNA分子，以及转化细菌生殖保存等步骤。基因的分别的方法：DNA文库建立〔cDNA文库、基因组文库〕、PCR、RT-PCR.隆基因编码区的改造：密码子偏爱性：细菌等原核生物三联密码子的第三位上偏爱A、U等，即NNUNNAGC。AU〔55%左右〕，单子叶植物的基因一般G或C〔75%左右〕mRNA的稳定性基因的构建〔了解〕：1、器官〔组织特异性 基因克隆启动子〕2〔CaMV35S〕启动子 终止信号区増强子或〔和内含子〕“増强基因的表达”编码区4-10基因表达盒的根本构成示意图常用的选择标记和报导基因：选择标记基因主要是一些抗生素抗性基因或除草剂抗性基因4(》农业生物技术重要学问点梳理汇总报导基因主要是一些编码催化人工底物产生颜色变化的酶5(》农业生物技术重要学问点梳理汇总或编码荧光蛋白的基因.npt-lI基因:NPT-1I可以催化氨基糖昔类抗生素〔如霉素、卡那霉素、G418和庆犬霉素等〕磷酸化。经磷酸化的抗生素不能与核糖体上的作用为点结合，而失去干扰细胞合成蛋白质的力气，因而使抗生素失效。bar基因：解毒机理：PPT对植物造成毒害的机理可能是抑制了植物细胞内谷氨合成酶〔GS〕活性所致。bar基因编码PPT乙酰转移酶〔Phosphinothricinacetyltransferase,PAT〕,使PPT的氨基乙酰化。乙PPTGS无抑制作用，因而对植物失去毒性。uidA1、组织化学染色法〔直观〕2、GUS活性的荧光分析法GFP基因基因转化：载体介导法：农杆菌介导的基因转化①根癌农杆菌，产生冠瘻瘤〔Ti质粒〕；发根农杆菌，形成毛状根〔Ri质粒〕。Ti质粒GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCALB(25bp)诱」口

200kb

LB、RB两边界长均为25bp,且正向重复OHAASSAS：乙酰丁香酮；OHASa-務基乙酰丁香酮6(》农业生物技术重要学问点梳理汇总(》农业生物技术重要学问点梳理汇总②T-DNA:7携带的基因具有典型的真核生物类型的转录信号，如5”端TATA/CAAT盒，3”端polyAo携带有致瘤基因(编码植物激素：生长素和细胞分裂素)。至少含有一种编码合成稀有氨基酸(或衍生物)的基因，这种氨基酸只有农杆菌可利用，作为生长、生殖所需的碳源和氮源。T-DNA的转化需要Vir区基因的表达和左右边界(LBRB)的存在Ti6个步骤(了解)：农杆菌对受体的识别；农杆菌附着到植物受体细胞；诱导启动毒性区基因表达；类似接合孔复合体的合成和装配；T-DNA的加工和转运；T-DNA整合。Ti质粒的改造：改造策略：将两端边界之间的局部除去，将含有限制性内切酶位点或人工合成的多克隆位点(含有一个或多个单一的限制性內切酶位点)DNA片段置在两边界序列之间并与之连接。改造的后优点：削减了Ti质粒的分子量；Ti质粒称Ti质粒”(disarmedTiplasmid):有了单一酶切点，可插入目的基因，单一酶切点(多克隆位T-DNA两边界序列之间，因此可将插入的目的基因整DNA内。⑥Ti质粒作为基因转化的载体有两种形式

f共整合载体“、双元载体VirT-DNA位于同一质粒上，只需处于同一细菌中病毒介导法(2)DNA直接导入法J聚乙二醇(PEG)介导法化学方法:［脂质体介导法物理方法］

基因枪轰击法显微注射法电激转化法超声波介导法激光微束导入法低能离子束介导法

种「花粉管通道法质系统 生殖细胞浸泡法介导I胚囊、子房注射法法转基因植物的分子分析

-整合水平(DNA)三个水平分析虫转录水平(RNA)I翻译水平(蛋白)核酸杂交分析(详见课件)Southern杂交分析：DNA提耳一■＞限制性内切酶酶切一电泳转膜一预杂交_杂交~放射自显影DNADAN杂交带谱的状况，可获得两种信息：其一，证明目的基因是否已经导入并整合到植物基因组；其二，目的基因的拷贝数及存在状态。Northern杂交分析：DNADAN杂交带谱的状况，可知：外源基因在转基因植株中是否进展了有效转录.Western杂交技术其它分析技术10a.点杂交11总b.PCR技术-荧光定量PCRc.ELISA〔酶联免疫吸附反响〕ELISA检测技术的根本方法：A.直接法；B.间接法；C.体夹心法第五章基因工程与植物性状改进改进农产品品质贮藏蛋白贮藏淀粉直链淀粉、支链淀粉贮藏脂肪不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸改进脂肪酸组成的基因工程：a.提高饱和脂肪酸含量ACP〔18:0—ACP,饱和脂肪酸〕酶活性和81本＜—身几乎检测不到，硬脂酸含丿呈提高20倍。 片39%。

ACP脱饱和酶〔甘蓝型油菜〉抑制不饱和脂肪酸b 降低饱和脂肪酸含量

RNA技术3StACPII基因〔海狸〕3ACPI基因II 、；^iS-ACP ACPACP硫脂两导入大豆基因〔交

棕桐酸含£下降硫脂BS

导入油菜IIIIII饱和月旨肪酸含严〕共抑制Kt-S-ACP老鼠和醉母的硬脂酰UOA脱饱和酶基因

活性降低 呈下降3倍饱和月旨肪酸+ACP-SII饱和脂肪酸含呈下降(》农业生物技术重要学问点梳理汇总基因工程改善光合碳代谢途径：提高C02固定力气〔 C3、C4途径〕降低光呼吸〔光合效率降低25%〕提高蔗糖和淀粉的合成速率雄性不育基因工程〔杂种优势〕d$同花：三系配套〔不育系、恢复系、保持系〕d$异花：人工去雄〔化学去雄〕利用基因工程制造不育系和保持系：基因工程制造不育系的三条途径：特异表达细胞毒素途径黑曲霉RNAaseTi； 芽砲杆菌的核酸酶Barnase等花粉特异启动子一细胞毒素基因-------------------Barnase基因导入烟草92%的转基因植株雄性不育，缘由是破坏了绒毡层发育所致反义RNA途径技术阻断与花粉发育有关基因表达as〔CHS〕XTHS导入矮牵牛花粉不正常.花粉粒呈白色，雄性不肓提早降解月并月氐质壁途径拟南茨花粉发育早期启动子P-1,3-BS导入烟草转基因植株中包围四分体砲子的*1,3-葡聚糖壁层永久丧失.小抱子不育.雄性不育。(总(2) 基因工程制造保持系的两种篆略(了解):V策略A不育基因一抗除草剂基因转基因植株x 非转基因植株(抗除草剂.不育) (不抗除草剂、可育)除草剂

不育+抗除草剂

杂交 1可育+不抗除草剂 除草剂V策略11＞： 细胞毒素反义RNA技术TA29-RNAasegene导入油菜

RNA基因细胞毒素(RNAa§£)导入正常植株不育系 导入 恢复系¥(S/IT)植物抗病机制：非寄主抗性

aX保持系(N/rr)X不肓系(S/rr) 保持系(N/rr)植物自身存在的构造屏障通过识别入侵病原而诱导产生的一系列防卫反响基因对基因概念：毒性基因

(》农业生物技术重要学问点梳理汇总 产物的毒性基因：胞外水解酶、胞外多糖、毒素、植物激素未知产物的毒性基因：hrp基因、dsp基因无毒基因打算病原菌小种与含相应抗病基因的寄主植物表现专化性不亲和性〔抗性〕。无毒基因直接或间接编码的产物，是能在含有相应抗病基因的寄主植物上引起抗病反响的激发子，它是与抗病基因产物〔受体〕结合的配体。抗病基因概念：在基因对基因假说中，抗病基因打算寄主植物对病原菌专化识别。抗病基因产物是抗病反响信号传导链的起始组分，当它与病原菌的无毒基因直接或间接产物结合后，通过信号传导，激发植物防卫基因表达，引发抗病反响。抗病基因可在小种或致病变种水平打算抗病专化性。植物抗病基因与植物防卫反响基因区分：码植保素合成链中的酶基因〔pal、chs、PR〕,编码细胞成分合成酶基因〔HPRGP、木质素〕。抗病基因产物是防卫反响基因直接或间接的调整因子。抗病基因的克隆：Hm1基因：第一个被克隆的抗病基因，不符合基因对基因模式。Pto基因：第一被克隆的符合基因对基因模式的植物抗病基因。门•植物病毒基因组构造〔了解〕TMVvCMVxPVX等，功能类似于真核生物的mRNA,mRNA与核糖体的识别，有利于翻铎起始复合物的形成以及防止核酸酶的降解

篇毒编码小分子蛋白质，以\共价方式与歹端结合。PVYv邑豆花叶病毒组、蠕传多角体病毎组。功能：可能与病奇复制有关，可能作为引物分子启始复制编码区

PolyA(RNA3*OH5•端非编码区。长MlO-lOObpoA、U含■£丰富，有些病青的能形成二级“发夹”构造。一5•端非编码区序列馥与基因的复制与表达的调控图单链正义RNAC+ssRNA〕病毒的基因组构造病毒基因的功能：衣壳蛋白(》农业生物技术重要学问点梳理汇总(》农业生物技术重要学问点梳理汇总基因(CP)、病毒的RNA植物抗病毒基因工程：CPRNA、反义RNA、复制酶基因、核酶、缺陷干扰颗粒、RNA介导的抗病性。RNA介导的抗病性：RNA沉默本质----转录后的基因沉默(PostTranscriptionalGeneSilencing,PTGS),细胞核内高速转录，细胞质内降解。RNA介导抗性的特征：表现型与免疫相像抗性更长期抗性范围窄(多病毒片段重组转化——嵌合基因)非翻译RNA的应用，更安全miRNAsiRNA的不同点(了解)：miRNA是内源的；而siRNARNA干预的中间产物。构造上，miRNA是单链RNA,siRNARNA。Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他局部降解；而siRNARNA的前体的两侧臂。在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。14.植物抗真菌基因工程抗真菌蛋白基因核糖体灭活蛋白(RIP)基因概念及机制：RIP来自于植物，是一类作用于真核生物细胞核糖体，抑制蛋白质合成的蛋白毒素。RIP并不灭活其自身的核糖体，却能特异地作用亲缘关系较远的种类(如真菌的核糖体)。植保素基因过氧化物酶基因抗病基因和无毒基因“双元件组份”抗病基因工程策略(cf9/avr9cf4/avr4)抗细菌基因工程植物抗病基因降解致病毒素的基因杀(抗)菌肽基因槪念：杀(抗)菌肽是指昆虫体内分泌的一类存在于血淋巴中的碱稳定性蛋白。机制：杀(抗)菌肽的抗菌活性依靠于其两亲性的a-螺旋构造。这种构造使之可以在原核细胞膜上形成巨犬的时间性及电压依靠性的离子通道，致使细胞内外的渗透压转变，细胞內容物，K+大量渗出，细菌因此死亡。溶菌酶基因植物抗虫机制：物理防范机制化学防范机制另外抗病机制：蛋白酶抑制剂、外源凝集素植物来源抗虫基因蛋白酶抑制剂基因(PI)杀虫机理：a制剂复合物(EI),从而阻断或减弱蛋白酶对于外源蛋白质的水解作用，导致蛋白质不能被正常消化；b.EI产生厌食反响。这样，昆虫由于缺乏生活代谢中所需的一些氨基酸，必定导致昆虫发育不正常或死亡。c.此外，蛋白酶抑制剂分子可能通过消化道进入昆虫的血淋巴系统，从而严峻干扰昆虫的蜕皮过程和免疫功能，以致昆虫不能正常发育。种类：丝氨酸蛋白酶抑制剂：虹豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)一个抑制剂分子有两个抑制活性中心，可同时竞争性地抑制两个胰蛋白酶分子。马铃薯蛋白酶抑制剂(PIT、PHII)马铃薯和番茄PIT只有一个活性中心，主要抑制胰凝乳蛋白酶活性。Pl-II有两个活性中心，可分别抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性。疏基蛋白酶抑制剂a-淀粉酶抑制剂植物凝集素基因Bt毒蛋白基因的杀虫机理：Bt毒蛋白在伴孑包晶体内以原毒素(protoxin)形式存在，当被昆虫取食后，在昆虫中肠碱性和复原性环境下，毒蛋白溶解。毒蛋白一经溶解，在蛋白酶作用下，通过专一性蛋白水解酶切割，原毒素被活化，转型为毒性多肽分子。活化的毒蛋白与受体结合，这些受体位于中肠上皮的微绒毛N和钙粘着蛋白(cadherin)类似物，结合于受体的蛋白随之插入到细胞膜上并形成穿孔，使细胞膜周质和中膜腔之间的离子平衡被破坏，引起细胞肿胀甚至裂解，从而导致瘫痪或死亡。Bt毒蛋白基因的保守性和动态性：保守性5”端高度变异，3”100氨基酸处保守疏水跨膜序列Bt毒蛋白基因或同一Bt毒蛋白基因存在于不同苏云金杆株系中，这种现象称为Bt毒蛋白基因的动态性。Bt毒蛋白基因的应用中存在问题：表达量低耐药性策略：提高表达量：BtN端局部；并加一強启动子；Bt基因定点突变，改掉可能降低其在植物中转录和翻译的序列(95%同源性)；使用植物偏爱密码子，删除可能形成mRNA二级构造序d 不同来源的Bt基因进展拼接和重组，提高表达蛋白稳定I性。I耐药性对篆：

(》农业生物技术重要学问点梳理汇总使用组织特异性的启动子或化学诱导(水杨酸)启动子;Bt基因；复合基因策略。Bt+CpTI抗低温基因工程抗冻肽的作用机制：一般认为，它们是在低于溶液平衡冰点之下温度阻挡冰晶生成，抑制冰晶生长；它们不是作为溶质使水溶液冰点下降，而是吸附于冰晶外表，降低水的冰点。氨基酸序列分析觉察4-7个苏氨酸和天冬氨酸残基可与冰晶结合。抗盐抗旱基因工程：Na+/H+运输系统、K+运输系统和吸水通道蛋白抗早熟、抗年轻基因工程「跃亦型 Q.与果实內乙烯的宀亠亠［跃叉生 匕释放亲热相关果头成熟＜非跃变型纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶活性提高，降解细胞壁利用基因工程把握果实成熟二条途径：把握乙烯的产生LE-ACC2M

导入番茹

ACC脱氮酶”乙烯合成降低！＞9.5%,果实不成熟。不变•

乙烯合成呈降低，果实成熟变慢.贮藏期OIIRNA

红，不变牧。 CH3CH2-CCOOH+NH+NH2-CH-cooiiCH)2CH!JMl®

NH2- CH-cooiiQI(2s^2CH(3S腺甘酰丝氨酸

3a-ftH丁酸NH3+ COOCH2氮基环丙烷亠幾酸(ACC)

ACC脱轴(Met)

(SAM) CH2=C112十CO2+NH3十I1COOH乙烯EFERNA

号入蕃茄

97%被抑制，果实着色违应变慢，贮就期延长农业生物技术重要学问点梳理汇总反义RNA技术抑制细胞壁降解第六章分子标记技术及其在农业中的应用限制性片段长度多态性(RFLP)DNA中核昔酸排列挨次发生转变。当这种碱基的转变涉及到限制性內切酶识别位点时，利用限制性内切酶可将DNA切割成RFLPoDNA(RAPD)原理：是将随机引物(通常9-10个碱基)与聚合酶链式反响(PCR)相DNA的不同位点。假设基因组某些区域发生变异而导致特定结合位点的分布发生相应变化，会使产物增加、削减DNA的多态性。RAPD与标准PCR区分：RAPD9-10bpoG+C含量40%以上。标准PCR,必需依据的序列设计特点的引物，长度最好在20bp以上，G+C50%o在每个RAPD612条片段)，而不是标准PCR的一对引物。RAPD36°C),能够产生严格且65°C)。PCRDNA进展分析的效率。扩增片段长度多态性(AFLP)AFLPRFLPPCR相结合的一种产物简洁序列重复标记(SSR)基因芯片：指对数以千计的DNA片段同时进展处理分析的技DNA突变谱和mRNA表达谱的检测等。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进展杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而猎取样品分子的数量和序列信息。农业生物技术重要学问点梳理汇总16.(1)

j原位合成型从点阵的制备方法来分主要有两类｛“点膜,，型(2)从支持物来分主要有：.薄膜型、玻片型、微板型、集成电路型DNA芯片检测应用(了解)标记关心选择(MarkerAssistedSeIection,MAS):利用与目的性状严密连锁的分子标记进展育种筛选，可以准确的观看该基因在后代个体中分别状况。第七章转基因动物及动物克隆技术转基因动物的争论目的 (了解)基因争论的需要促进动物生长，改善生产性状，加強抗病力生产药用蛋白——动物生物反响器DNA导入方法：显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞法、精子载体法反转录病毒法：将目的基因重组到反转录病毒载体上，制成高滴度的病毒颗粒，人为感染复制前或复制后胚胎，或将能释放反转录病毒的单层细胞与胚胎共培育以感染胚胎。DNA导入全ES细胞中，然后将其植入正常的囊胚腔中，获得转基动物。胚胎干细胞：是指哺乳动物在囊胚期前的各个发育阶段，胚胎细胞中的内细胞具有分化为各种器官组织的高度潜能，这种细胞称为胚胎干细胞(embryonictotipotentstemcell,ES)。转基因动物鉴定：固相放射免疫测定(RIA)竞争性RIA、固定抗原、双抗体RIA法RT-PCRRnase保护分析〔》农业生物技术重要学问点梳理汇总原生殖细胞〔PGCs〕:配子的前体，鸡胚孵化第三天这些细胞进入血液循环并迁移到发育着的性腺即生殖崎上，最终发生减数分裂产生精子和卵子。体外培育的胚胎细胞或体细胞的细胞核与受体细胞质在细胞周期上相互协调可获得具有发育潜能的重组胚胎成熟促进因子：M期促进因子〔maturationpromotingfactor,MPF〕，真MM期转变,MPF具有蛋白激酶的活性。G2期到达顶峰，从有丝分裂中期向后期进展过程中消逝。MPF对移植核的作用：Mil期的卵母细胞，MilMPF含量高，MPF将诱导移植核发生一系列形态变化，包括核膜裂开〔NEBD〕、早熟染色体凝集〔PCC〕,NEBD和PCC对重组胚胎发育的影响，取决于供体核的细胞周期。卵母细胞的活化方式：电激法〔家畜〕、化学激活、總、精子提取液获得具有发育潜能的重组胚胎的两条途径：G1期〔或GO期〕的细胞核移入MlI期的卵母细胞中；任何时期〔G1、G2、S期〕的细胞核移入活化的卵母细胞中。第八章动植