一种模拟人体小口径动脉脉动流的生物反应器

一种模拟人体小口径动脉脉动流的生物反应器

临床上，动脉粥样硬化的动脉重建术通常使用较大的异构血管（如大隐静脉和内动脉）作为移植植物。但是自体的血管来源有限,并且对人体造成了第二次损伤。另外一种方法就是应用人工合成血管如膨化聚四氟乙烯(ePTFE)和涤纶(Dacron)作为动脉替代物重建动脉。这些人造血管用于大、中动脉的替代效果令人满意。但在用于小口径(<6mm)血管替代时,由于缺少血管内皮细胞,小口径血流速度缓慢导致移植早期急性血栓形成,移植后期吻合口内膜增生引起管腔狭窄直至闭塞,通畅率很难达到要求。基于组织工程技术构建的细胞-生物材料复合物,经体外构建后植入体内,与宿主血管组织融合生长和组织重塑,恢复血管连续性和血流通畅,被认为是最理想的血管替代物。随着研究的不断深入,大量的实验研究证明,血流动力学在构建小口径组织工程血管的过程中起着重要的作用。因此迫切需要制造一种能模拟血管脉动流的生物反应器。对于血管生物反应器的设计,特别是适用于小口径(3~6mm)的生物反应器,要求能提供脉动的流体力学环境,脉动的压力和流量可以任意调节,以模拟不同口径的血管组织。反应器要能提供充分的营养、气体交换,以便能使高细胞密度的组织在体外存活。反应器的结构要能够适合细胞接种操作,保证在构建过程中的体外操作部分具有高的成功率。反应器要能保证系统的密闭、无菌和恒温,为组织的成熟提供条件;并且整套反应器的灭菌要方便,拆卸和组装要方便快捷,具有可操作性。本文设计并制造了能够模拟人体小口径动脉脉动流的生物反应器。该生物反应器是在中国药品生物制品检定所医疗器械监督检验中心使用的TH-1200人工心脏瓣膜脉动流检测装置的基础上进行改造而成。此外,还将一段活组织管放在反应器内接种内皮细胞,进行动态培养,证明了反应器的实用性。1材料和方法1.1实验装置的设计按照相似原理对心血管系统进行简化从而建立模型。在TH-1200人工心脏瓣膜脉动流检测装置的基础上对实验装置的各个部分进行了具体的结构设计,主要任务是使得实验装置尽可能具有较好的模拟性和可调性。实验装置由以下部件组成循环回路。1.1.1生国资源充放电整理的性能驱动装置的动力源是直线电机(清华大学生物力学研究室提供)。驱动的信号是由波形发生器(清华大学生物力学研究室提供)产生。波形发生器具有以下性能:①波形发生器可以产生任意波形。②波形发生器的脉动频率调节范围很宽,从30~300次/min。这样的频率范围涵盖了大多数哺乳动物不同年龄阶段的心跳频率。③改变振幅的大小可以调整心室的冲量容积。由于活塞直径为30mm,行程为25mm。因此冲量容积变化最大可达17ml。直线电机的最大推力可达3kg,产生的压强可达到300mmHg,满足产生生理压力波形的要求。1.1.2室方式左心室内储液箱是用来贮存内循环系统的内皮细胞培养液。内储液箱模拟人体的心房,不断往心室充盈培养液。内储液箱是带有一个流入口和流出口的玻璃容器。从循环系统中流回的培养液从流入口进入储液箱,然后培养液再从流出口流进模拟的左心室。连接内储液箱和左心室的塑料软管可以弯曲,可以通过升高和降低储液箱的高度来调节心房与心室之间的压力差。1.1.3液体加压均匀左心室模拟囊是由透明的弹性硅橡胶制成的,其弹性可以通过改变硅橡胶的成分和控制厚度来改变,得到合适的心室弹性。模拟左心室的硅橡胶囊有两个出口,每个出口处装有一个机械瓣膜,分别连接内储液箱和下游管路。为了使得模拟左心室硅橡胶囊壁的运动与人体的相似,采用了液体加压均匀膨胀收缩的方法。为此,将心室硅橡胶囊放置在一个密封透明的容器中。容器中充满了密封的水,并与一个活塞相连。通过活塞的运动来挤压容器中的水,从而对左心室模拟囊均匀施加压力作用。当波形发生器输出左心室容积变化信号时,驱动直线电机的活塞上下运动。活塞挤压着密封容器里的水。由于流体的不可压缩性质,活塞的行程以及运行快慢反映心室容积变化的曲线。通过水压的作用将波形和动力传递给浸没在其中的左心室硅橡胶囊,从而使得左心室硅橡胶囊能够模拟人体左心室的动力功能。1.1.4系统调度的调节后负荷控制系统由顺应腔串连一个阻力器组成。顺应腔也叫液容,它是一个直径40mm高90mm的玻璃容器。液容的上方有一个透气孔,连接一个0.2μm的细菌过滤膜。通过透气孔来调节顺应腔气体和液体的比例从而改变系统的顺应性。液容的下方有一个流入口和一个流出口,流入口连接左心室的主动脉瓣,流出口连接下游的管路。液面的高低可以通过顺应腔上方的排气口来调节,从而调节管路系统的顺应性。阻力器是内径为5mm的有机玻璃管,内装许多内径0.2mm长度10mm的镍管。它和调节阀连接在一起。调节阀是螺杆挡板式的,调节挡板位置即可调节外周阻力的大小。这种阻力器是由细的钢性管组成(管长/直径≫l)可以认为是层流流动。压差和流量之间成线性关系,这就是Wosterhof阻力器。1.1.5压力传感器traft模拟装置系统中的压力是动态压力,对传感器的要求:温漂小,线性好,具有一定的频响和灵敏度。由于测试的时间长,因此对传感器特别要求有较好的稳定性。本套装置采用的压力传感器(美国爱德华生命科学公司TruWave)为桥式压力传感器,其性能指标如下:压力传感器的测压范围从为-50~300mmHg;压力传感器的重复性能允差为量程的±2%;压力传感器的灵敏度为5μV/mmHg±2%;压力传感器的非线性及滞后现象为量程的±2%或者1mmHg;压力传感器的零点热效应漂移为±10μV/℃;压力传感器的零点时间漂移为±30μV/8h(37℃条件下)。传感器的输出经放大器放大的电信号送入示波器,直接显示记录。1.1.6培养液剪切力的计算方法流量的测定采用玻璃转子流量计(余姚市振兴流量计厂LZB)。流量计的测量范围为0.04~0.6L/min。剪切力的大小通过流量来计算。剪切力计算公式为:τ=32μQ/πD3式中,μ为培养液的黏度;Q为反应器内培养液单位时间的流量;D为血管支架的内直径。1.1.7接头及密封腔体生物反应器培养室包括一套旋转器件和密封腔体。旋转器件与密封腔体采用硅橡胶O型圈配合。旋转器件包括低速直流电机和带齿轮旋转杆。低速直流电机的转速为6~60r/h,可以连续调节。三维支架接在带齿轮旋转杆的接头上,并用无菌手术缝线绑紧。接头的表面覆盖有一层约0.3mm厚的硅橡胶膜,可防止脉动下培养液渗漏。接头与旋转杆采用螺纹加硅橡胶垫圈配合。左右两个接头分别采用正反两种螺纹与旋转杆连接,这样有助于在装配三维支架后始终顺着同一旋转方向拧紧接头。接头的外径尺寸径为2.5~6mm,以配合不同直径的三维支架材料。低速直流电机驱动带齿轮旋转杆从而实现细胞在三维支架上的旋转接种。密封腔体包括一段圆形管和左右两端的密封盖。圆形管的材料为玻璃。圆形管的上下两侧各有一个流入口和流出口,用于细胞-三维支架复合物的培养液外循环。密封盖的材料为医用316L不锈钢。两个密封盖与圆形管的密封配合采用法兰和硅橡胶垫圈。1.1.8外储液箱的工艺流程是培养“三维抗病液”的重要条件生长在三维支架内腔面以及支架内部细胞的物质交换主要依靠脉动压力下的培养液渗透。而外储液箱能为生长在三维支架外层的细胞提供营养物质。外循环的培养液从培养室的流出口流出,经过蠕动泵泵到外储液箱中。外储液箱的培养液在重力的作用下流入培养室内。这样就保证了三维支架外培养液的循环。1.1.9连接管道整套系统用医用聚氯乙烯管连接,管与管之间的连接采用鲁尔接头,方便拆卸和连接。医用聚氯乙烯管可以在包装后采用环氧乙烷灭菌。1.1.1空气混合式液的工艺流程将整套血管生物反应器装配好以后放置在37℃饱和湿度的二氧化碳培养箱里。由于反应器里培养液体比表面积小,相比培养瓶里培养液与空气的接触面积小很多。因此为了保持培养液的二氧化碳浓度平衡和氧气的供给,将5%二氧化碳-95%空气混合气体经0.2μm无菌滤膜过滤后,直接流入内外储液箱的液面上。这样就保证了培养液的气体交换。1.2皮细胞的分离无菌条件下取狗颈总静脉。用0.1%的Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)溶液37℃下20min消化分离血管内皮细胞。获得的细胞传5~8代扩增后使用。1.3肉芽组织的包装无菌硅橡胶管(长50mm,外径4mm)植入狗腹腔内,在3周时间内被肉芽组织完全包裹。取出包囊组织,去掉硅胶管,剩下的肉芽组织就是活组织管。本实验中采用的活组织管长度为5cm,厚度为0.2mm±0.05mm。1.4细胞增殖和动态培养反应器的所有部件经环氧乙烷灭菌,在超净工作台内将内径为4mm的活组织管首先套进反应器里旋转杆的接头上,并用手术缝线绑紧。反应器的内储液箱加M199完全培养液,外储液箱加平滑肌培养液(M199基础培养液加10%胎牛血清)。消化1瓶75cm2的细胞成悬浮液,约为1.5ml。用3ml的注射器吸取1.5ml细胞悬浮液从培养室一端的医用三通阀注进活组织管腔内。启动低速直流电机的开关,调节电压,使得旋转速度为5~8r/h。经过3.5h的旋转接种后,吸出管腔内的残余细胞悬浮液,再次消化1瓶75cm2的细胞成悬浮液,约为1.5ml进行二次接种。当二次接种结束以后启动波形发生器,调节顺应腔的空气比例,调节阻力调节开关,使得液体的流量约为0.01ml/min,只有液体交换效果,近似于静态培养。静态培养2天以后,调节阻力开关,使得流量逐步增大,不断增加剪切力的强度。(1.5±0.8)dyn/cm2动态培养2天,(5.3±2.4)dyn/cm2动态培养1天。动态培养脉动的频率为60~70次/min。(注:1dym/cm2=0.1Pa。)1.5在动态组织培养前后的扫描电镜分析中细胞种植前后以及动态培养后活组织管用4%多聚甲醛溶液固定,用扫描电镜观测活组织管的内腔面。2结果与讨论2.1优点三:创建合适的流场设计并制造的组织工程血管生物反应器如图1和图2所示,与国内外现有的相比具有以下特点:①驱动装置的动力源采用直线电机。国内外一般都使用蠕动泵、呼吸机、血泵等。蠕动泵主要是利用凸轮产生的正弦波,不能相似于人体的波形,要做成相似于人体左心室容积变化曲线的难度较大,而且凸轮曲线既不容易加工也不容易调整,冲量容积不能改变。呼吸机是靠旋转泵的叶片产生压缩空气,压缩空气作用在与液体相隔的弹性膜(如硅橡胶膜),从而推动液体的流动。同样地,呼吸机也不能模拟人体血液的脉动流。呼吸机的频率只有一种,不能随意改变。血泵的原理是通过泵的旋转叶片推动液体的流动,同样不能模拟人体血液的脉动流。②波形发生器可以方便得到任意波形,单独调节脉冲频率和幅度。可以通过不同波形、不同频率下的培养实验摸索最佳的培养条件。波形发生器结构简单可靠,调节方便灵活。③反应器的接种操作简单,减少操作步骤,降低了污染的可能。该装置的培养室能使旋转接种和脉动培养连续进行,并且可以进行二次接种。2.2内皮细胞的动态图3显示硅橡胶在狗的腹腔内由于异物炎症反应形成的活组织生物管。图4显示活组织生物管内表面大量纤维状及膜状的细胞外基质成分,基质下隐约可见细胞胞体及纤维样突起。图5显示旋转接种7h后内皮细胞铺满整个内腔面。有些细胞开始伸展,有的细胞仍然是圆形的。活组织管内腔面自体的胶原纤维有利于内皮细胞的黏附和伸展。高密度的接种能够保证有足够多的细胞在旋转情况下黏附在管腔表面。图6显示经过旋转接种和静态培养两天后内腔表面形成融合单层的内皮细胞。细胞保持健康,完全伸展,呈鹅卵石形状,彼此之间有一定的极向性,但整体取向杂乱。图7显示内皮细胞经过静态培养两天、低剪切力(1.5±0.8)dyn/cm2下动态培养两天后,大多数的细胞形态拉长并顺着流体方向取向排列。内皮细胞覆盖着整个内腔面。图8显示内皮细胞经过静态培养两天、(1.5±0.8)dyn/cm2动态培养两天、(5.3±2.4)dyn/cm2动态培养一天后,细胞的形态进一步拉长,内皮细胞覆盖着整个内腔面,没有细胞脱落现象。剪切力(5.3±2.4)dyn/cm2的数值大小在静脉血流剪切力的范围内。内皮细胞形态变化显示,膜蛋白和细胞骨架蛋白在进行着调整和重组以适应流体剪切力的变化。融合单层内