海洋放线菌srepomycessplxf-80的分离与鉴定

海洋放线菌srepomycessplxf-80的分离与鉴定

放线菌是自然界活动的重要来源。在发现的22500多种微生物活性物质的二级代谢产物中，有1065种来自放线菌，其中76%来自链菌。经过50多年的探索从陆生放线菌中发现新菌种、新活性物质的几率大大降低,于是人们把眼光投向具有高压、高盐、缺氧、低温、寡营养等独特环境特点的巨大的资源宝库———海洋。在这种特殊的生存环境中,海洋放线菌必定进化出不同于陆生放线菌的独特的代谢机制,这就为新颖的活性产物的产生提供了重要的条件［２－３］。已有研究表明,海洋放线菌次级代谢产物丰富,包括内酯类,萜类,生物碱类等,部分化合物的结构及生物活性表现出与陆生放线菌显著的差异［４］。海洋沉积物是营养较为丰富的生物栖息地［５］。近年研究发现,海洋沉积物中的放线菌多样性非常丰富［６－７］,这为微生物次级代谢产物研究提供了重要的资源。本研究针对采集自黄海、渤海的沉积物样品,进行海洋放线菌的分离,并采取以化学筛选为主,活性筛选为辅的模式进行菌株的筛选,以期获得具有研究价值的放线菌,并对其代谢产物进行研究。从黄海和渤海2个来源的海泥样品中分离到142株放线菌,经化学筛选后获得27株次级代谢产物丰富的潜力菌株,经SRB法活性测试发现其中15株具有良好的抗肿瘤活性。本研究首先选择了菌株Streptomycessp.LXF-80作为目标研究菌株,其发酵液粗提物的HPLC指纹图谱分析,显示出有1个含量较高且紫外吸收较特殊的化合物以及一些呈系列吸收的化合物的特征峰,并对该部分的代谢产物进行了系统的研究。跟踪研究结果,从中分离得到结构复杂的聚酮类化合物Enterocin(1)和4个环二肽类化合物(2~5)。化合物1是1个罕见的包含α-吡喃酮的三环骈和聚酮结构,在已报道的文献中,该类结构仅有3个,其特殊的三环骈和结构是在生源合成途径中经历1个罕见的Favorskii-likerearrange-ment氧化重排反应［１５－１７］而得到的。该聚酮化合物的发现为海洋放线菌聚酮生物合成途径的研究提供了重要的资源。1实验部分1.1材料、仪器和活性核磁共振仪(日本JeolJNM-ECP600型);质谱仪(MarinerAPI-TOP型);制备高效液相色谱仪(Waters600泵,Waters996二极管阵列检测器,Millennium32工作站,YMCC18柱:5μm,4.6mm);高压灭菌锅(MLS3750日本三洋株式会社);洁净工作台(AirTech苏州安泰空气技术有限公司);高速离心机(德国BECKMAN公司);恒温培养箱(MIR-253SANYO公司);旋转式振动培养箱(TC-C-100R高崎科学器械株式会社);超声仪(VC750美国SONICS公司);真空浓缩仪(SC250DDASavant公司);相差倒置显微镜(CK40OLYMPUS公司);二氧化碳培养箱(MCO175SANYO公司);EYELAN-N型旋转薄膜蒸发仪(TokyoRikakikaiCO.LTD);SephadexLH-20(Pharmacia公司);硅胶H(200~400目)(青岛海洋化工厂产品)。活性测试采用小鼠P388肿瘤细胞;胎牛血清(FBS)(Hy-clone公司);RP-MI-1640培养基(Gibcobrl公司);磺酰罗丹明B(SRB)(Sigma公司)。提取分离用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿等均为工业用化学纯产品,重蒸后使用,液相色谱甲醇为色谱纯。1.2菌株的分离和筛选1.2.1样本来源所分离的样品来源于黄海及渤海的海泥。1.2.2培养基的添加(1)分离条件选取5种培养基作为放线菌分离的培养基:高氏一号培养基,YEM培养基,M2培养基,几丁质琼脂培养基,酪蛋白-丙酸钠培养基。所有的培养基中均添加3.3%的海水素,并分别添加抑制剂:制霉菌素(100mg·mL－１)和萘啶酮酸(20mg·mL－１);制霉菌素(100mg·mL－１)和硫酸新霉素(20mg·mL－１)。(2)分离方法样品采用稀释涂布法涂布于分离培养基上,28℃培养,挑取形态差异较大的单菌落,纯化后4℃冰箱中保存。1.2.3菌种活性、薄层色谱和展开梯度(1)发酵培养基放线菌2号:可溶性淀粉10g,葡萄糖20g,酵母膏10g,牛肉膏1g,玉米浆3g,KH２PO４0.5g,MgSO４·7H２O0.5g,CaCO３2g,海水素33g,水1000mL,pH=7.0。(2)化学排重用500mL三角瓶装150mL发酵培养基,将分离所得菌种取适量接种,置于摇床28℃,180r/min振荡培养,培养7d。发酵产物乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯层真空浓缩至干,得到提取物。用TLC薄层色谱排除薄层行为相似的菌株(显色剂:香草醛浓硫酸;展开梯度:CH２Cl２∶MeOH=13∶1),保留薄层行为差异较大,产物丰富的菌株。(3)活性筛选将化学排重后保留的粗提物加甲醇配成浓度10mg·mL－１,超声振荡溶解,按照文献［８］采用SRB法并结合显微镜观察细胞形态变化,进行活性评价。1.350.等级1植物lxf-80的后代1.3.1l放线菌培养培养基在无菌条件下,接种菌体于内装150mL放线菌2号培养基的500mL的三角瓶内,置于摇床28℃,180r/min振荡培养,培养7d。共发酵65L。1.3.2丙酮浸膏的制备将发酵培养物离心分离菌丝体和发酵液,菌丝体部分丙酮浸泡过夜,抽滤,减压浓缩后用乙酸乙酯萃取,浓缩得到浸膏7g,发酵液乙酸乙酯萃取,浓缩得到浸膏33g,将两部分浸膏合并,共得到浸膏40g。1.3.3相同的组分，相同的分组总浸膏减压硅胶柱层析,石油醚-二氯甲烷-甲醇梯度洗脱,收集不同组分,浓缩后经TLC检测合并相同的组分后得到7个组分;其中组分Fr.3经ODS减压反相硅胶柱色谱,凝胶柱色谱(Seph-adexLH-20,甲醇),中压色谱和高效液相色谱等方法分离得到化合物1(150mg),化合物2(4.4mg),化合物3(6mg),化合物4(1.7mg),化合物5(3.8mg)。2结果2.1渤海海泥样品来源从黄海和渤海的海泥样品中共分离到放线菌142株,其中来源于黄海海泥样品的有90株,来源于渤海海泥样品的有52株。菌株经形态排重后剩余91株,发酵产物经TLC薄层色谱化学排重后剩余27株,对化学排重后的27株菌进行P388细胞活性测试,抑制率高于阳性药5-氟尿嘧啶(43%)的活性菌株有15株,具体活性数据如表1。2.2菌株的筛选与分离对化学排重后的27株菌进行HPLC指纹图谱的分析,结果发现菌株LXF-80的代谢产物丰富,有1个含量较高且紫外吸收较特殊的化合物(tＲ=24.6min,λｍａｘ=237.6nm)以及一些呈系列吸收的特征峰(指纹图谱如图1所示),因此选取该菌株作为目标菌株,以期获得这个量大的主产物及其他呈系列吸收的化合物。菌株LXF-80来源于渤海海泥样品,从加有制霉菌素(100mg·L－１)和萘啶酮酸(20mg·L－１)抑制剂的酪蛋白-丙酸钠培养基中分离纯化得到。经过16SrDNA序列比对,初步鉴定为链霉菌Streptomycessp.(GenBank登录号为:JX912298)。2.3被氧甲基取代的吡喃酮结构化合物1:白色无定型粉末。阳离子ESI-MS在m/z445给出准分子离子峰[M+H]＋提示化合物分子量为444,结合１HNMR(600MHz,DM-SO-d６)和１３CNMR(150MHz,DMSO-d６)推出分子式为C２２H２０O１０,不饱和度13。化合物氢谱给出20个氢信号,碳谱给出22个碳信号,包括:9个C,11个CH,1个CH２,1个CH３信号。根据一维谱图的5个芳香氢信号H-18、H-18’[δ:7.79(2H,d,J=7.14Hz)],H-19、H-19’[δ:7.51(2H,t,J=7.68Hz)],H-20[δ:7.61(1H,t,J=7.14Hz)]结合碳谱6个芳香碳信号C-17[δ:140.2],C-20[δ:133.2],C-18、C-18’[δ:128.9],C-19、C-19’[δ:128.5]及二维HMBC谱中H-18与羰基碳C-16[δ:195.5]相关确定了苯甲酰的结构片段。2个烯氢信号H-11[δ:6.30(1H,d,J=2.22Hz)],H-13[δ:5.62(1H,d,J=2.22Hz)]结合4个sp２杂化碳信号C-12[δ:171.3],C-10[δ:163.9],C-11[δ:105.3],C-13[δ:88.4]及1个缔合的羰基碳信号C-14[δ:162.1]并结合HMBC谱中氧甲基信号H-15[δ:3.83(3H,s)]与C-12相关确定为12位被氧甲基取代的吡喃酮结构。在二维１H-１HCOSY谱中,给出了两组相关信号:H-6[δ:4.65(1H,m)]/H-7[δ:2.29(1H,dd,J=3.3Hz,14.28Hz),1.67(1H,dd,J=2.76Hz,14.28Hz)];H-5[δ:4.48(1H,m)]/5-OH[δ:5.67(1H,d,J=5.52Hz)],结合HMBC谱中的以下信号:H-6与C-5[δ:69.8]相关;H-7与C-8[δ:76.0]相关;8-OH[δ:5.92(1H,s)]与C-7[δ:35.5]相关;H-9[δ:4.67(1H,d,J=2.76Hz)]与C-8,C-4[δ:78.7]相关;4-OH[δ:5.51(1H,s)]与C-4,C-5相关可以得到1个多羟基取代的六元环结构。由于化合物的不饱和度为13,在已得到的片段中,共11个不饱和度,由此推测剩余的2个不饱和度可能为2个环状结构,在HMBC谱中2-OH[δ:5.89(1H,s)]与缔合的羰基碳C-1[δ:174.3]及C-2[δ:80.4],C-3[δ:55.2],C-8相关;4-OH与C-3相关,由这些相关信号结合化合物的分子式及不饱和度和C-6化学位移值可将其与得到的六元环相连成为三环骈合结构。此外,H-3[δ:4.47(1H,s)]与C-16相关可将苯甲酰取代基与中间部分的三环结构相连接;H-11与C-9[δ:77.0]相关可以将吡喃酮环与中间部分相连接。通过SciFinder查询并与文献[9-10]数据比对,确定该化合物的结构为enterocin。化合物2:白色无定型粉末。阳离子ESI-MS在m/z300给出准分子离子峰[M+H]＋提示分子量为299,结合１HNMR和１３CNMR推出分子式为C１７H２１N３O２,不饱和度9。１HNMR(600MHz,DMSO-d６)给出20个氢信号:2个活泼氢信号H-5[δ:8.07(1H,s)],H-2[δ:7.97(1H,s)]结合1个次甲基信号H-6[δ:4.09(1H,s)]提示为环二肽类化合物典型的特征信号。另外1个活泼氢信号H-15[δ:10.9(1H,s)]结合5个芳香氢信号H-10[δ:7.55(1H,d,J=7.68Hz)],H-13[δ:7.30(1H,d,J=7.68Hz)],H-12[δ:7.02(1H,t,J=7.14Hz)],H-16[δ:7.02(1H,s)],H-11[δ:6.92(1H,t,J=7.68Hz)]提示为吲哚的特征信号;次甲基氢信号H-18[δ:-0.06~-0.02(1H,m)]结合2个亚甲基氢信号H-7[δ:3.27(1H,dd,J=3.84Hz,14.28Hz),2.99(1H,dd,J=4.38Hz,14.28Hz)],H-17[δ:1.14~1.23(1H,m),0.61~0.64(1H,m)]及2个甲基氢信号H-19[δ:0.53(3H,d,J=6.6Hz)],H-19’[δ:0.42(3H,d,J=6.6Hz)]提示为异丁基。另外还有2个氢信号H-7[δ:3.27(1H,dd,J=3.84Hz,14.28Hz),2.99(1H,dd,J=4.38Hz,14.28Hz)]根据其耦合常数提示为1个亚甲基。通过与文献数据比对,化合物的旋光[α]Ｄ２５-3.4(c1,MeOH)数值与文献接近,旋光方向相同,由此确定该化合物为Cyclo-(L-Trp-L-Lue)。化合物3:白色无定型粉末。阳离子ESI-MS在m/z286给出准分子离子峰[M+H]＋提示分子量为285,分子式为C１６H１９N３O２,不饱和度9。1HNMR(600MHz,DMSO-d６)共给出19个氢信号,与化合物2的氢谱相似,包括以下信号:3个活泼氢信号H-15[δ:10.9(1H,s)],H-5[δ:8.00(1H,s)],H-2[δ:7.88(1H,s)];5个芳香氢信号H-10[δ:7.59(1H,d,J=7.68Hz)],H-13[δ:7.29(1H,d,J=7.74Hz)],H-12[δ:7.01(1H,t,J=7.74Hz)],H-11[δ:6.93(1H,t,J=7.2Hz)],H-16[δ:7.06(1H,s)];3个次甲基信号H-6[δ:4.13(1H,s)],H-3[δ:3.48(1H,s)],H-17[δ:1.63(1H,m)];1个亚甲基信号H-7[δ:3.21(1H,dd,J=4.92Hz,14.82Hz),3.05(1H,dd,J=4.92Hz,14.82Hz)];2个甲基信号H-18[δ:0.59(3H,d,J=7.14Hz)],H-18’[δ:0.16(3H,d,J=6.6Hz)]。通过与化合物2氢谱比对,两者有相同的骨架,不同之处在于化合物3用异丙基代替了化合物2的异丁基。通过与文献比对,化合物的旋光[α]Ｄ２５-35.4(c1,MeOH)数值与文献接近,旋光方向相同,确定了化合物3为Cyclo-(L-Trp-L-Ala)。化合物4:白色无定型粉末。阳离子ESI-MS在m/z334给出准分子离子峰[M+H]＋提示分子量为333,分子式为C２０H１９N３O２,不饱和度13。1HNMR(600MHz,DMSO-d６)共给出19个氢信号:包括3个活泼氢信号H-15[δ:10.9(1H,s)],H-2[δ:7.73(1H,s)],H-5[δ:7.93(1H,s)];10个芳香氢信号,其中H-19、H-19’[δ:7.18(2H,m)],H-20、H-20’[δ:6.70(2H,m)],H-21[δ:7.16(1H,m)]提示为单取代苯环;H-10[δ:7.47(1H,d,J=7.68Hz)],H-13[δ:7.31(1H,d,J=7.68Hz)],H-12[δ:7.06(1H,t)],H-11[δ:7.00(1H,t)],H-16[δ:6.96(1H,s)]为吲哚环的氢信号;2个次甲基信号H-6[δ:3.97(1H,s)],H-3[δ:3.85(1H,s)]为典型的环二肽特征α-H信号;2个亚甲基信号H-7[δ:2.80(1H,dd,J=4.38Hz,14.82Hz),2.44(1H,dd,J=4.38Hz,14.82Hz)],H-17[δ:2.52(1H,m),1.85(1H,m)]。化合物4与化合物2有相同的骨架,不同之处在于其用苯环代替了化合物2的异丁基。通过与文献数据比对,化合物的旋光[α]Ｄ２５-99.8(c1,MeOH)数值与文献接近,旋光方向相同,确定该结构为Cyclo-(L-Trp-L-Phe)。化合物5:淡黄色无定型粉末。阳离子ESI-MS在m/z247给出准分子离子峰[M+H]＋提示分子量为246,分子式为C１４H１８N２O２,不饱和度7。１HNMR(600MHz,DMSO-d６)给出18个氢信号:包括2个活泼氢信号H-5[δ:8.12(1H,s)],H-2[δ:7.91(1H,s)]为NH信号;5个芳香氢信号H-9、H-9’、H-10、H-10’、H-11[δ:7.23-7.17(5H,m)]提示为单取代的苯环;2个次甲基信号H-6[δ:4.21(1H,s)],H-3[δ:3.53(1H,s)]为环二肽特征α-H信号;1个亚甲基氢信号H-7[δ:3.15(1H,dd,J=6.00Hz,12.00Hz),2.86(1H,dd,J=6.00Hz,12.00Hz)];此外1个次甲基信号H-12[δ:1.69(1H,m)]结合2个甲基信号H-13[δ:0.64(3H,d,J=6.6Hz)],H-13’[δ:0.24(3H,d,J=6.6Hz)]提示为异丙基。通过与文献比对,化合物的旋光[α]Ｄ２５-48.6(c1,MeOH)数值与文献接近,旋光方向相同,确定了化合物5为Cyc