超临界二氧化碳萃取锁阳中黄酮的工艺研究

超临界二氧化碳萃取锁阳中黄酮的工艺研究

又名“不老药”、“金不换”、“沙漠人参”等。这是锁阳科的一种独特植物，主要产于甘肃、内蒙古、新疆、青海、宁夏等地。这是中医和蒙古语中常用的补充剂和延长寿命。过去锁阳主要用作药材或鲜食,近年来研究证明,锁阳在防癌、抗癌、免疫调节、延缓衰老、防治心血管疾病、治疗白细胞减少等方面有明显的效果。锁阳中的黄酮类化合物主要为儿茶素、柑桔素4′-O-吡喃葡萄糖及一种以柑桔素为苷元的配糖体。研究表明,黄酮类化合物具有广谱的药理活性和较低的毒性,除具有抗菌、抗炎、降血脂等作用外,在抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、增强机体免疫机能等方面也具有明显功效。有研究发现,黄酮类化合物除了可以通过抑制体内与自由基产生有关的酶活性而发挥抗氧化作用外,还可以通过增加体内抗氧化物酶活性达到抗氧化目的,是一种天然的抗氧化剂。从植物中提取黄酮的方法有许多种,如醇提法、水提法、超声提取与超临界CO2萃取法等。超临界流体萃取(Supercriticalfluidextraction,SFE)技术是一种新型的分离技术,可在温和的条件下实现对原料中热敏性及难挥发性成分的分离提取,保持天然产物的特性,已广泛用于食品、中药、香料等领域。超临界流体萃取方法具有产品收率高、质量好、有效成分破坏少、无溶剂残留、操作方便等优点,是当今生物活性物质提取的新热点。目前对锁阳中黄酮类化合物的萃取工艺及生理活性报道不多,本文研究了超临界CO2萃取锁阳中黄酮类化合物的工艺参数,确定了最佳萃取工艺。该工艺具有萃取率高、速度快、操作简便等优点,可用于锁阳中黄酮类化合物的提取。1材料和机器1.1药物、生物检验所提供的对照品锁阳:购于甘肃兰州,由北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定;芦丁对照品(北京药品生物检验所提供,批号:100080-200707);无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(均为分析纯)。1.2紫外分光光度计BP-1580-81超临界萃取装置(日本Jasco公司);760CRT双光束紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。2方法2.1工艺锁阳→60℃恒温干燥→粉碎→过筛→称重→超临界萃取→萃取产物定容。2.2单因素实验与正交实验分别对萃取压力、温度、时间、夹带剂浓度(采用乙醇为夹带剂)、夹带比(夹带剂流量与CO2流量的百分比)、CO2流量、锁阳颗粒度(过筛目数)等进行单因素实验,确定影响总黄酮萃取率的较佳水平范围,并采用7因素3水平正交实验,确定最佳萃取条件。2.3标准曲线的绘制准确称取芦丁对照品0.01038g,加入30%的乙醇溶液充分溶解并定容至50mL,得到0.2mg/mL标准液。分别取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mL的芦丁标准液于7个10mL容量瓶中,先分别加入0.3mL5%的NaNO2溶液,摇匀,放置6min后,再加入0.3mL10%的Al(NO3)3溶液,放置6min后,再加入4mL4%的NaOH溶液,并用30%乙醇溶液定容到10mL,放置15min,以空白为对照在510nm处测吸光度,以对照品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线,A=11.90C-0.0119,R=0.991。2.4萃取率的测定,当分萃取率按以下步骤计算吸取2.0mL样品液于10mL容量瓶中,按照“2.3”中所述方法操作,测吸光度,利用回归方程求出样品所含黄酮的浓度,按以下公式求出萃取液中黄酮的萃取率。总黄酮得率(%)=C×X×V×100%/W×1000式中:C——样品所测总黄酮的浓度,mg/mLX——萃取液稀释的倍数V——萃取液体积,mLW——样品(锁阳)质量,g3结果与分析3.1单因素实验3.1.1不同粒径目筛的黄酮含量准确称取一定量样品放入萃取釜中,以95%乙醇作夹带剂,分别用过20～40、40～60、60～80、80～100、100～120目筛的锁阳颗粒,在萃取压力30MPa,萃取温度50℃,萃取时间1h,夹带比6%,CO2流量4mL/min的相同条件下进行萃取实验,测定总黄酮含量。结果见图1。由图1可以看出,随着粒径的减小(颗粒过筛目数的增大),萃取率增加。当颗粒粒径过80～100目筛时,萃取率达到最高,颗粒过细易堵筛网。为此选择40～60、60～80、80～100目作为正交实验的粒度影响因素的水平。3.1.2萃取压力的选择准确称取一定量过60～80目筛样品放入萃取釜中,以95%乙醇作夹带剂,在萃取温度50℃,萃取时间1h,夹带比6%,CO2流量4mL/min的相同条件下,分别取10MPa、15MPa、20MPa、25MPa、30MPa、35MPa进行萃取实验,测定黄酮含量。结果见图2。由图2可以看出,随着萃取压力的增大,黄酮的萃取率也随之增大,当压力>30MPa,萃取率反而下降,这是因为随着萃取压力的增大,超临界CO2的密度增大,溶质与溶剂之间的传质效率增加,溶解能力随之增加。但是随着压力增大,流体流量升高,减少了流体在物料中的传质接触时间,且物料粉末压缩得更紧密,黄酮溶出变难,导致萃取率下降,同时过高的压力对设备的要求提高,考虑到设备压力、操作成本及安全,选定20、25、30MPa作为正交实验的压力水平。3.1.3不同温度下黄酮萃取效果的测定准确称取一定量过60～80目筛样品放入萃取釜中,以95%乙醇作夹带剂,在萃取压力25MPa,萃取时间1h,夹带比6%,CO2流量4mL/min的相同条件下,分别设定35、40、50、60、70℃下进行萃取实验,测定总黄酮含量。结果见图3。由图3可以看出,黄酮萃取率随着温度升高而升高,当温度高于60℃后,萃取率下降,这是因为萃取温度对萃取效果具有双重的影响。一方面,温度升高,物质的蒸汽压增大,物质在超临界CO2流体中的溶解度增大,有利于黄酮类化合物的萃出。另一方面温度升高,CO2流体的密度降低,导致CO2流体的溶剂化效应下降,使物质在其中的溶解度下降,对萃取不利。根据实验结果,选定40、50、60℃作为正交实验的温度影响因素的水平。3.1.4萃取时间的选择准确称取一定量过60～80目筛样品放入萃取釜中,以95%乙醇作夹带剂,在萃取压力30MPa,萃取温度50℃,夹带比6%,CO2流量4mL/min的相同条件下,分别取30min、45min、60min、75min、90min进行萃取实验,测定总黄酮含量。结果见图4。由图4可以看出,随着萃取时间的增长,萃取率提高较快。但75min后,曲线上升趋缓,表明总黄酮萃出量很少,这是由于在萃取初期,超临界流体CO2与溶质未达到良好接触,萃取量少;萃取一定时间后,超临界流体与黄酮类化合物逐渐接近溶解平衡;再增加萃取时间,萃取率增加有限。且随着时间的延长,超临界萃取的能耗也在增加,为此考虑到萃取设备的能耗,选定45、60、75min作为正交实验的时间影响因素的水平。3.1.5流量对总黄酮萃取率的影响准确称取一定量过60～80目筛样品放入萃取釜中,以95%乙醇作夹带剂,在萃取压力30MPa,萃取温度50℃,萃取时间1h,夹带比6%的相同条件下,分别对CO2流量为1mL/min、2mL/min、3mL/min、4mL/min、5mL/min进行萃取实验,测定总黄酮含量。结果见图5。由图5可以看出,随着CO2流量的增加,总黄酮萃取率也随之增加,当流量达到4mL/min后,萃取率随CO2流量的增加变化不大。当CO2流量增加时,它流经原料层的速度增加,从而增大萃取过程的传质推动力,使传质速率加快,提高超临界CO2流体的溶解能力。不过,流量增大也同时增大了能耗,使成本增加。因此,从运行成本考虑,选择3mL/min、4mL/min、5mL/min作为正交实验的CO2流量影响因素的水平。3.1.6带剂的总黄酮含量测定准确称取一定量过60～80目筛样品放入萃取釜中,在萃取压力30MPa,萃取温度50℃,萃取时间1h,夹带比6%,CO2流速4mL/min的相同条件下,分别以50%、60%、70%、95%乙醇作为夹带剂进行萃取实验,测定总黄酮含量。结果见图6。由图6可以看出,夹带剂乙醇的浓度对总黄酮萃取率的影响显著,夹带剂乙醇浓度为95%时的总黄酮萃取率明显低于夹带剂乙醇浓度为50%时的萃取率;随着夹带剂中乙醇浓度的升高,总黄酮的萃取率明显下降。原因是锁阳中黄酮类化合物极性较大,而超临界CO2流体对极性较强的溶质溶解能力明显不足,极性夹带剂可明显增加极性溶质在超临界CO2流体的溶解度。但是,实验中当夹带剂乙醇浓度达到40%时,限流管发生堵塞,实验无法继续进行。因此选定正交试验中夹带剂乙醇浓度影响因素的水平为50%、70%、95%。3.1.7不同夹层比对黄酮含量的影响准确称取一定量过60～80目筛样品放入萃取釜中,以95%乙醇作夹带剂,在萃取压力30MPa,萃取温度50℃,萃取时间1h,CO2流量4mL/min的相同条件下,分别取夹带比为2%、4%、6%、8%、10%进行萃取实验,测定总黄酮含量。结果见图7。由于黄酮类化合物在超临界CO2流体中的溶解度极低,因此需要在超临界流体系统中加入少量的夹带剂来改变超临界流体系统的相行为,增大溶质在超临界流体中的溶解度。本文采用夹带比来体现夹带剂的用量,由图7可以看出,随着夹带剂用量的增大,有利于黄酮类化合物的溶出,黄酮的萃取率升高。根据实验选定正交试验中夹带剂用量影响因素的水平为4%、6%、8%。3.2正交实验3.2.1最佳萃取工艺的确定根据各单因素实验结果,设计了7因素3水平正交实验,因素水平表见表1,正交实验结果见表2。由表1、2可以看出,萃取率最佳的工艺为A3B2C3D1E3F2G2,即压力30MPa、温度50℃、时间75min,夹带剂浓度50%、夹带比8%、CO2流量5mL/min、颗粒浓度60～80目。各因素对萃取率影响的大小次序为D>E>F>A>G>B>C,即夹带剂浓度>夹带比>CO2流量>压力>颗粒度>温度>时间。3.2.2最佳萃取工艺验证实验结果为验证最佳工艺条件,在最佳工艺条件(压力30MPa、温度50℃、时间75min,夹带剂浓度50%、夹带比8%、CO2流量5mL/min、颗粒度60～80目)下进行验证实验3次,结果见表3。由表3可见,最佳工艺条件下,锁阳中黄酮的萃取率大于正交实验18组数据,证明上述工艺参数为最佳萃取工艺。此条件下锁阳中黄酮的萃取率达21.18%。4不同钢夹剂浓度下锁阳中黄酮萃取率的比较4.1超临界CO2流体萃取锁阳中黄酮类化合物时,夹带剂乙醇的浓度对黄酮萃取率的影响显著。采用锁阳粒度60