大连海域海洋中一种具有广谱抗菌活性的小单孢菌属菌种

大连海域海洋中一种具有广谱抗菌活性的小单孢菌属菌种

最初，这种小型单胞菌是以形态特征命名的。它是发达的、无呼吸的细菌，具有独特的贝壳形状、鞭毛和水生植物。目前，报告了40种小单胞菌。小单胞菌广泛分布于土壤、水和土壤中，尤其是在固体土壤肿瘤的发病率100%。抗生菌、紫苏菌和福提霉素被临床应用，这是第二个由小单胞菌产生的抗生素。此外，小单胞菌和它们是肿瘤活性物质的主要来源，包括b、rakicidinb、diazepian、thom-whyn等。近些年来由于抗药性问题日益严重,寻找具有新型作用机制的抗生素已迫在眉睫.海洋小单孢菌属由于其分布广泛以及特殊生长环境(高盐、高压、低温、寡营养),有可能产生结构新颖、活性广泛的抗菌活性物质.我国大连海域海岸线占辽宁省海岸线总长度的73%,蕴藏着丰富的海洋放线菌资源.2008年,矫文策等首次在大连地区海泥样品中分离到具有抗菌活性的小单孢菌种M.aurantiaca.林灵等对大连老虎滩海域沉积物进行了生物多样性研究,并分离到11个科共15属的放线菌,显示了我国大连海域放线菌资源的多样性.本实验室对大连新港、金海岸海域以及丹东鸭绿江口沉积物海泥进行研究,共分离到318株海洋放线菌,本研究拟对其中1株具有广谱抗菌活性的小单孢菌进行了分类鉴定,以期为进一步开发海洋小单孢菌属放线菌提供一定的科学参考.1材料和方法1.1试验材料1.1.1样品及其制备丹东鸭绿江口沉积物海泥样品13份,新港、金海岸海域沉积物海泥样品6份.取样时,取水深20m以下的样品,置于灭菌塑料袋中,迅速带回实验室置4℃保存备用.1.1.2培养基、培养基分离培养基:淀粉-酪蛋白酸钠培养基(SC):可溶性淀粉10g,酪蛋白酸钠0.3g,KNO32g,K2HPO4·3H2O1.0g,MgSO4·7H2O0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,琼脂15g,以人造海水定容1000mL,pH7.0～7.4,37μmg制霉菌素,25μmg重铬酸钾.纯化培养基及形态观察ISP系列培养基均参考文献,种子培养基及发酵培养基均参照文献.以上培养基以蒸馏水和人造海水各500mL定容,pH7.0～7.4,121℃灭菌30min.1.2测试方法1.2.1菌株纯化sc平板海泥样品经预处理:终浓度1.5%苯酚处理30min,100℃加热1min以及1.5%吐温80(500μg/mLAMP),27℃振荡2h后,稀释到浓度为10-3、10-4、10-5稀释液.各吸取0.2mL稀释液涂布在含37μg/mL制霉菌素以及25μg/mL重铬酸钾的SC平板上,每份样品3次重复.28℃恒温培养30d,观察菌落生长情况.分离菌株在SC培养基上进行纯化,2%蛋白胨-80℃冻干管保存.1.2.2菌株形态观察,出现预菌和内菌菌的形态鉴定,排除链霉菌.采用插片培养法,28℃培养14d,观察菌株的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形态,依据文献进行放线菌形态观察和显微结构特征鉴定,排除链霉菌.1.2.3培训功能主要采用国际规定的ISP系列培养基及营养琼脂培养基,28℃培养,分别于7、14、21、28d进行观察,依据文献进行鉴定.1.2.4生理生化特征的测定1.2.4.1.温度生长承受试验采用海水配置的Bennett琼脂培养基作为基础培养基,分别在4、10、15、20、28、37、40、45℃条件下划线培养20d.1.2.4.2.盐浓度试验菌株分别接种于NaCl浓度为0%、3%、5%、7%、9%、12%的Bennett液体培养基,28℃摇床培养.1.2.4.ph值的调值采用人工海水配置的Bennett液体培养基和pH缓冲液(灭菌)混合,用无菌的NaOH和HCl将混合液pH值分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、pH9.0及10.0,接种,28℃摇床培养.1.2.4.4碳氮源试验不同碳氮源经乙醚灭菌后分别按0.1%和0.5%浓度加入普戈二氏无碳源基础培养基以及氮源利用基础培养基.1.2.4.5.酶学特性实验参照文献测定明胶液化、淀粉水解、牛奶胨化、硝酸盐还原等酶学特性以及H2S、黑色素代谢产物.以上均培养20d,每5d观察1次.1.2.5blast比较分析参考微波法提取总DNA,PCR扩增16SrRNA序列,测序结果输入GenBank数据库进行Blast比较,用MEGA5软件构建Neighbor-Joining(N-J)树,并进行Bootstrap分析.1.2.6分析细胞化学组的分类参照文献进行细胞壁主要氨基酸以及全细胞水解糖分析.1.2.7抗菌活性的测定采用菌碟法,以大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Stephylococcusaureus)、番茄溃疡病菌(Clavibatermichiganensis)、尖刀镰孢菌(Fusariumoxysporum)、辣椒疫霉(Phytophthora-copsici)以及本试验分离到的弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)为指示菌进行抗菌活性测定.2结果与分析2.1菌株的抗菌谱在大连新港海域沉积物海泥样品中分离到1株抗菌活性较强的放线菌,编号为MN10,其抗菌谱如图1所示.该菌具有拮抗革兰氏阳性菌的强活性,且对尖刀镰孢菌、弯曲假单胞菌均有抑菌活性,但对大肠杆菌、番茄溃疡病菌、辣椒疫霉无抑菌活性,对枯草芽孢杆菌的抑菌活性不稳定.2.2放线菌m10的分离培养将放线菌接种于SC平板培养7d,观察菌落形态.由图2～3看出,该菌落成微黄色,圆形,隆起.无气生菌丝,基内菌丝发达,无色素产生,并经传代后仍比较稳定.将放线菌MN10菌株接种至ISP2平板作插片培养,14d后取下插片,在扫描电子显微镜下观察菌落形态(图4).放线菌MN10基内菌丝体发达,分枝,有横隔,菌丝连续不断裂,无气生菌丝,无孢子链和孢子囊;孢子呈球形,椭球形,表面光滑,单个着生在短孢子梗上,无鞭毛,不游动.2.3浅黄、浅灰色可溶性色素放线菌MN10在ISP2、ISP3、ISP5培养基上生长良好,在IS2、ISP3、ISP7以及营养琼脂培养基上产生浅黄、浅棕色可溶性色素,如表1所示.2.4两种糖质体培养基的生长特性放线菌MN10能降解淀粉、酪氨酸,使明胶液化,牛奶胨化,但不能还原硝酸盐,不产生黑色素和硫化氢;能利用D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-核糖、蜜二糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、棉子糖,对甘油利用较弱,不利用乳糖、L-鼠李糖、水杨苷、D-甘露醇.以Bennett培养基为基础培养基进行温度、pH以及盐耐受试验测定,结果显示,MN10在温度为15～40℃,pH为6～9,NaCl浓度为0～5%范围内均能生长,其中,生长的最适温度为25～30℃,最适NaCl浓度为3%,接近海洋环境盐浓度;在温度45℃以及NaCl浓度为7%的条件不能生长,有别于小单孢菌种M.marina,如表2所示.2.5表型筛选、转染与细胞氨基酸经全细胞TLC以及纯细胞壁水解分析表明,菌株MN10细胞壁氨基酸主要组成为meso-DAP、甘氨酸,细胞壁型为Ⅱ型;全细胞水解液检测到葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖、阿拉伯糖,糖型为D型.2.6srrna基因序列及系统发育树分析放线菌MN10的16SrRNA经PCR扩增并测序,获得基因序列,GenBank序列号为JX193794.将所测序列与GenBankDatebase相关菌株进行16SrRNABlast比对,并建立系统发育树,结果如图5所示.2.7菌株的确定m10通过形态和培养特征、生理生化特征以及细胞壁化学组成分析对放线菌MN10进行分类研究,初步确定MN10菌株为小单孢菌科小单孢菌属;16SrRNA基因序列分析显示,MN10菌株(JX193794)与M.marina(99.652%)、M.aurantiaca(99.449%)、M.coxensis(99.035%)、M.echinospora(99.006%)同源性均在99%以上,确定菌株MN10为Micromonospora.sp;且与M.marina(AB196712)形成1个支系,亲缘关系最近,初步鉴定菌株MN10为小单孢菌种Micromonosporamarinasp.nov.除最高生长温度以及NaCl耐受盐度不同之外,MN10菌株的生理生化特性与Micromonosporamarina基本一致..3主要的海洋小单孢菌属的分离和鉴定大连海域存在丰富的海洋放线菌资源,近年来分子生物学方法已经证明绝大部分的海洋放线菌仍然是难以培养的.海洋小单孢菌属由于其生长周期较长,易受真菌、细菌、杆菌污染,因此出菌率较链霉菌低.Nonomura和Ohara等研究发现120℃左右干热处理1h对小单孢菌的孢子影响不大,但可以显著降低链霉菌和丝状细菌的干扰.Hayakawa等研究表明经1.5%的苯酚、葡萄糖酸洗必泰(CG,0.01%)和苄索氯铵(BC,0.01%)30℃处理30min可杀死链霉菌孢子、杆菌以及假单胞菌的营养细胞,而小单孢菌属孢子却表现出一定的耐受性.本试验预处理采用121℃高温加热、1.5%苯酚处理以及吐温80摇床培养,显著降低了链霉菌、细菌、真菌以及杆菌的污染.吐温80作为一种表面活性剂,有利于孢子分散在稀释液中,提高了小单孢菌的出菌率.分离到的菌株MicromonosporamarinaMN10传代培养稳定,基本解决了该菌种的纯培养问题,为进一步开发海洋小单孢菌属奠定了一定基础.该菌具有拮抗革兰氏阳性菌的强活性,且对尖刀镰孢菌、弯曲假单胞菌均有抑菌活性,具有广谱抗菌活性,但对大肠杆菌、番茄溃疡病菌、辣椒疫霉无抑菌活性,且对枯草芽孢杆菌的抗菌活性不稳定,其抑菌机制待进一步研究.Hirsch等报道小单孢菌的抑菌活性,不仅仅是通过合成抗真菌和抗微生物的活性成分,还通过激活防御途径的key基因最终抑制病原菌的生长.相比于链霉菌,无论从抗生素的产量及种类来看,小单孢菌属都是仅次于链霉菌属的产生新型活性物质的重要来源.但海洋来源的小单孢菌属出菌率较低,很难在实验室中实现其次生代谢产物的生产,将其产生次生代谢产物的基因簇转化到已知工程菌种进行异源表达成为目前研究的热点.Thiocoraline是由小单孢菌科中发现的一种环硫代缩酚酸肽类的酶抑制剂,它可显著抑制DNA及RNA的合成,对革兰氏阳性菌株具有强抑菌活性.Lombó等成功实现了海洋来源的小单孢菌Micromonosporasp.ACM2-092和Mic