肉和肉制品中酵母菌和霉菌的计数方法

肉和肉制品中酵母菌和霉菌的计数方法

本生物和细菌广泛分布于自然界，可作为食品中正常菌相的一部分。但在某些情况下,酵母菌和霉菌也可造成食品的腐败变质。引起肉类腐败的酵母菌多为假丝酵母属、隐球酵母属和胶红酵母属等。酵母造成败坏的典型特征是会导致一些肉制品表面产生大量的黏液,在肉制品内部生长则会产生类似于水果的腐败气味。引起肉制品腐败的霉菌多为青霉属、根霉属、枝孢属等。由于毛霉菌目、枝霉属、毛霉属和根霉属的存在,肉制品于冷藏状态下也会产生灰色到黑色的绒毛状或絮状菌丝。香肠制品、熟制腌肉中也常见由酵母菌和霉菌引起的腐败。即使是在低温下(1℃左右),酵母菌和霉菌也能够生长。由于我国尚未有肉和肉制品中酵母菌和霉菌的计数方法的国家标准。为了填补这一空白,国家加工食品质量监督检验中心(广州)承担了中国商业联合会下达的编号为20032486-T-601,名称为《肉和肉制品中酵母菌和霉菌的计数》的国家标准的任务。我们在充分收集、认真研究国内外相关标准及资料的基础上,等同采用了国际标准ISO13681:1995,结合本实验室的条件和本方法的技术特点,对多种不同类型的肉和肉制品进行了试验,通过反复研究和分析,建立了肉和肉制品中酵母菌和霉菌的计数方法。1材料和方法1.1菌种和培养基(1)菌种:大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉。以上菌种均购自广东省微生物研究所。试验用肉和肉制品样品购自超市。(2)培养基基础培养基:酵母膏5g,葡萄糖20g,琼脂15g,蒸馏水1000mL。调节pH6.6,115℃灭菌15min。土霉素溶液:土霉素(C22H30N2O4)50mg,蒸馏水25mL。土霉素溶于水,过滤除菌。庆大霉素溶液:庆大霉素25mg,蒸馏水25mL。庆大霉素溶于水,过滤除菌。完全培养基(酵母膏、葡萄糖和土霉素/庆大霉素琼脂培养基):分别将土霉素溶液和庆大霉素溶液各5mL加入到100mL的基础培养基中,置于47℃水浴中保温。1.2试样的制备和培养取样和试样的制备:取样和试样的制备方法参照ISO6887-2。初悬液及十倍稀释液的制备:按照ISO6887-1制备初悬液和进一步的十倍稀释液。接种和培养:取两个无菌平皿,如果产品为液体,无菌的转移1mL试样到每个平皿上;如果产品为固体或其他,则转移1mL初悬液到每个平皿上。用其他稀释液重复以上操作。倾注约15mL酵母膏、葡萄糖和土霉素/庆大霉素琼脂培养基到每个平皿上。从制备好试样到开始倾注平皿的时间应不超过15min。混合均匀,凝固后翻转平板,置20℃～25℃的培养箱中。1.3平板菌落培养培养3,4或5天后计算平板上的菌落数。5天后,保留菌落数在150以内的平板。如果部分平板被霉菌覆盖,或者很难计算出单菌落,则应该在培养4天(或3天)时计算菌落数。如果需要,用显微镜将较小的酵母菌和霉菌菌落与细菌的菌落区分开来。1.4第一稀释度保留度计算方法见表2选择菌落数在150以内的平板。计算每克或每毫升样品中的酵母菌和霉菌的数量。用下列公式:∑C:在所有保留的平板上的菌落总数。n1:第一稀释度保留的平板数。n2:第二稀释度保留的平板数。d:保留的第一稀释度的稀释因子。N为每mL或每g样品中酵母菌和霉菌的数量。单位为cfu/mL或cfu/g。如果在试样(液体样品)水平或初悬液(其他产品)水平的两个平板上的菌落数少于15个,计算两个平板上的菌落数的算术平均数y,结果表述为N=y(液体产品)或N=y/d(其它产品)。如果在试样(液体样品)或初悬液(其它样品)水平的平板上不含有任何菌落,则酵母菌和霉菌的结果表示为<1(液体样品)或<10(其它样品)。2结果与讨论2.1几种阳性菌株在不同培养基上的生长情况我们分别对十种阴性菌株和两种阳性菌株进行了试验,试验结果见表1。从试验结果可以看出,十种阴性菌株在酵母膏、葡萄糖和土霉素/庆大霉素琼脂培养基上都不能生长;两种阳性菌株在酵母膏、葡萄糖和土霉素/庆大霉素琼脂培养基生长状况良好。试验结果没有出现假阳性或假阴性情况,说明试验方法准确性较高,特异性较强。2.2新鲜肉样品中酵母菌和霉菌的检出情况我们对多种不同类型的肉和肉制品进行试验,试验结果见表2和表3。从冷藏、冷冻及新鲜肉的试验结果(见表2)可以看出,冷藏、冷冻和新鲜肉的表层样品由于屠宰、运输及贮藏过程中的各种污染,都有不同程度的酵母菌和霉菌的检出。而深层样品由于没有受到外界环境的污染,加上健康动物的内部组织本身是无菌的,所以酵母菌和霉菌的检出量较少,都为<10cfu/g。从部分肉制品的试验结果(见表3)可以看出,熟肉制品、香肠类和肉松、肉干类产品中酵母菌和霉菌的检出量都较低。而个别腊制品和预加工的肉制品中酵母菌和霉菌的检出量较高。3准确性和数据3.1对十种阴性菌株和两种阳性菌株进行了试验。十种阴性菌株在酵母膏、葡萄糖和土霉素/庆大霉素琼脂培养基上都不能生长;两种阳性菌株在酵母膏、葡萄糖和土霉素/庆大霉素琼脂培养基生长状况良好。试验结果没有出现假阳性或假阴性情况,说明试验方法准确性较高,特异性较强。3.2对冷藏肉、冷冻肉、新鲜肉、定量/非定量包装的熟肉制品、香肠类、肉松、肉干、