五倍子提取物提取液抗鼻咽癌的生物活性及其分子机制研究

五倍子提取物提取液抗鼻咽癌的生物活性及其分子机制研究

肛门肿瘤是中国南方最常见的肿瘤，容易早期感染和转移。根治性放疗后,复发率高,严重危害着人民的健康和生命。因此,寻找有效的方法防治鼻咽癌有非常重要的意义。鞣花酸(ellagicacid)是五倍子和石榴皮等植物组织中的一种天然多酚,化学成分为没食子酸二聚衍生物的多酚二内酯,呈反式没食子酸单宁结构,以游离或二聚体的形式存在,具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌等生物学活性。近年来,鞣花酸抗肿瘤和炎症的作用引起学者的广泛关注,鞣花酸对多种肿瘤细胞具有增殖抑制和凋亡诱导作用,但其对鼻咽癌的生物学作用的报道却不多。本文研究鞣花酸抗鼻咽癌的生物学活性,初步探讨其抗鼻咽癌作用的分子机制。1材料和方法1.1免疫组化检测人鼻咽癌5-8F细胞株(来源于桂林医学院科学实验中心);五倍子提取物鞣花酸(美国Alfa公司);RPMI1640培养基、小牛血清(美国Gibco公司);胰蛋白酶、甲基噻唑基四唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司);兔抗人stathmin抗体,兔抗人环氧化酶(COX-2)抗体(美国Bioworld公司);PVDF膜(美国Millipore公司);小鼠抗人β-actin抗体,辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG(碧云天生物技术有限公司);BCA蛋白定量试剂盒、ECL发光液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。1.2方法1.2.1完全培养基20%k人鼻咽癌5-8F细胞株接种于RPMI1640完全培养基(含10%小牛血清,100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素),置37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中培养。1.2.2实验组实验设对照组和实验组,实验组设3个药物浓度组(2,4,6μg/mL),对照组不用药物处理。1.2.3生长抑制率的测定采用0.25%胰蛋白酶消化鼻咽癌细胞,细胞以2×104个/mL接种于96孔板,200μL/孔。第2天更换培养液,加入实验设计鞣花酸浓度,每组设3个复孔,培养48h后,移去培养液,每孔加200μL无血清的培养液,20μLMTT(5mg/mL)继续培养4h后,弃去上清,加二甲基亚砜(DMSO)200μL/孔,避光振荡10min,待结晶体充分溶解后,利用酶标仪(490nm)测定各孔的吸光度值(OD值),计算细胞的生长抑制率。1.2.4花酸酯的合成用0.25%胰酶消化5-8F细胞,细胞按8×104个/孔接种于6孔板,培养过夜后,更换培养液,加入设定的鞣花酸浓度,培养48h,PBS洗2次,4%的多聚甲醛室温固定20min,PBS洗2次。然后,加入Hoechst33258荧光染料,染色10min。置倒置相差荧光显微镜下观察并采图。1.2.5流式细胞周期检测5-8F细胞接种于50mL的细胞培养瓶中,培养过夜后更换培养液。各组设3个复孔,按所设浓度分别加入鞣花酸,培养48h,收集各组细胞,1000r/min离心5min,PBS洗2次,用70%预冷乙醇悬浮细胞,4℃固定24h后,PBS洗2次,加入20μLRNaseA,37℃水浴30min,悬浮于1mLPI染液中,PI终浓度为50μg/mL,4℃避光30min后,流式细胞仪检测细胞周期。1.2.6总蛋白表达情况收集药物处理48h后的各组细胞,蛋白裂解液裂解细胞,置冰上15min,超声波处理后,12000r/min,4℃离心30min;分离上清液,采用BCA法测定上清液总蛋白浓度。取上清液总蛋白50μg与上样缓冲液混合,置沸水浴5~10min;然后,上样进行电泳,电泳完毕后,采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜;5%脱脂奶粉(TBST配置)封闭1h,加入一抗(1:500),30℃摇荡2h(或4℃过夜),TBST洗膜4次,5min/次,加入HRP标记的二抗,30℃,摇荡2h,TBST洗膜4次,5min/次,采用ECL发光液进行发光,X线片压片、显影、定影。1.3统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量数据用均数±标准差(ue0af±s)表示,多组资料比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1细胞抑制率比较五倍子提取物鞣花酸处理鼻咽癌5-8F细胞48h后,2,4和6μg/mL药物处理组细胞增殖均受到明显抑制,抑制率分别为(29.35±4.95)%,(53.32±4.44)%和(61.75±6.93)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),细胞抑制呈剂量依赖性。2.2两组细胞数量不同Hochest33258染色显示:对照组细胞均一,呈蓝色,细胞数量较多。实验组细胞数量明显减少,强蓝染的核浓缩和碎裂凋亡细胞增多(图1)。2.3细胞长期阻滞试验2,4和6μg/mL鞣花酸处理细胞48h,处于S期的细胞百分率分别为(25.47±0.74)%,(28.08±1.41)%和(35.49±0.66)%,与对照组(21.26±0.70)%比较,差异有统计学意义(P<0.01),细胞明显阻滞于S期(图2)。2.4尝试添加剂对stat分钟和cox-2结果的影响鞣花酸抑制5-8F细胞COX-2和stathmin的表达,随药物浓度增加,COX-2和stathmin的表达抑制越明显(图3)。3免疫调节作用鞣花酸对多种肿瘤具有抑制作用,其机制有:1)鞣花酸与致癌剂的活性代谢物结合形成无害的化合物,阻止致癌剂与细胞DNA结合;2)鞣花酸抑制亚硝基化合物、多环芳香类化合物和黄曲霉素B1等物质的代谢活性;3)鞣花酸诱导机体产生谷胱甘肽转硫(GST),催化还原型的谷胱苷肽(GSH)的巯基结合到疏水的化合物上,使亲电子化合物变成亲水的物质,将体内致癌物和断裂剂产生亲电子的潜在毒性物质降解排出,抑制细胞癌变。Malik等报道:鞣花酸具有抑制前列腺癌PC-3细胞的生长,并诱导细胞的凋亡的作用。Li等用鞣花酸处理膀胱癌T24细胞株后,细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞生长明显受到抑制。本实验结果显示:五倍子提取物鞣花酸对鼻咽癌细胞的增殖有明显抑制作用,具有剂量依赖性,6μg/mL鞣花酸作用48h,5-8F细胞的抑制率高达61%,并诱导细胞凋亡,阻滞细胞于S期。COX-2是一种膜结合蛋白酶,是前列腺素合成的限速酶。在多数正常细胞中,COX-2不表达或低表达,当受生长因子、内毒素及肿瘤促进因子等作用时呈高表达,参与炎症、肿瘤的发生与发展。COX-2在多种肿瘤组织中呈高表达,促进肿瘤细胞的增殖,抑制细胞的凋亡。塞来昔布具有选择性抑制COX-2表达,塞来昔布体外与胃癌细胞株BGC-823孵育,癌细胞增殖抑制,凋亡增强。沉默胃癌细胞COX-2,细胞周期阻滞,细胞增殖明显抑制。本研究中,鞣花酸处理鼻咽癌5-8F细胞48h后,COX-2的表达下调,细胞增殖受抑制。Stathmin是细胞质中普遍存在的微管调节磷蛋白,基因全长6.3kb,定位于人染色体1p35~36.1。Stathmin调控与细胞增殖和分化相关的多个信号分子和多条信号途径,在肿瘤细胞的侵袭、转移和血管生成等恶性表型的维持过程中起重要作用。抑制骨髓瘤细胞stathmin基因表达,可使细胞增殖力下降,生长受到抑制,细胞呈典型的凋亡细胞形态学改变,流式细胞术检测显示细胞周期阻滞于G2/M期,C3H小鼠移植瘤实验显示stathmin沉默的LM8骨髓瘤细胞致瘤能力降低,肿瘤生长减缓。沉默白血病K562细胞stathmin,细胞的增殖受到抑制。抗stathmin单克隆抗体和紫杉醇单用或联合使用,对HepG2细胞均具有