穿破石中黄酮类化合物提取分离、提取及鉴定

穿破石中黄酮类化合物提取分离、提取及鉴定

破碎石是属于桑科哲属植物结构的石头（cudraniakonimet）。错误的东西含量高，黄酮类化合物安全、无害，在医药、食品加工等方面得到广泛应用。多项研究表明黄酮类化合物除具有抗菌、消炎、清热解毒、镇静、利尿等作用外,在抗自由基和抗癌痛等疾病的治疗效果更显著。1材料和方法1.1材料表面1.1.1df-108s集热式一浴锅材料UV-1601紫外/可见分光光度计(北京瑞利分析仪),DF-102S集热式恒温水浴锅(巩义市英峪华仪仪器制造),电子天平,移液管,冷凝回流装置。1.1.2试剂芦丁标准品(含结晶水),95%乙醇(分析纯),5%NaNO:,10%A1(NO3)3,4%NaOH等。1.2方法1.2.1提取方法笔者采用有机溶液提取法,有机溶液为乙醇溶液。简单步骤是:把干燥穿破石根研碎,在回流提取,将提取液过滤。1.2.2测量量法用分光光度法测量,研究表明,此方法操作简便、可靠。1.2.3标准应用液的制备准确称取芦丁标准品25.00mg(含结晶水),用30%微热乙醇溶解,并完全移人50ml容量瓶中,用30%乙醇定容摇匀得浓度为0.1mg/ml的标准应用液。1.2.4加1.2.2回形法准确吸取标准应用液0、0.5、1.0、2.0、3.0ml分别置于10ml具塞的比试管中,用水稀释至2.40ml,先加5%NaNO2溶液0.40ml,摇匀,放置6min,然后加10%A1(NO3)3溶液0.40ml,摇匀后放置6min,最后加4%NaOH溶液4.0ml,用水稀释至10ml刻度,摇匀,放置15min。试剂为空白参比,在510mm波长处测定吸光度,以吸光度和浓度绘制标准曲线,得回归方程。1.2.5总黄酮含量的测定总黄酮含量测定采用亚硝酸钠一硝酸铝一氢氧化钠比色法精确吸取3份1ml样液于3支具塞试管中,各加5%NaNO:溶液0.40ml,摇匀,放置6min。加10%A1(NO3)溶液0.40ml,摇匀,放置6min.加4%NaOH溶液4.0ml,加对应浓度乙醇0.4ml,摇匀,放置10~15min。同时作试剂空白,以试剂空白作对照,在510nm波长处测定吸收度,计算总黄酮含量。提取率(%)=C×V1×V2×100%/M×1000式中C为由标准曲线计算得出样品总黄酮的浓度数值,单位为mg/ml,V1为提取液稀释的体积,单位为ml;V2为样液稀释的体积,单位为ml;M为样品的质量,单位为g。1.2.6单因素考察:单因素对穿破石总黄酮得率的影响单因素试验分别以不同的乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1:2、1:3、1:4、1:5、1:6)、提取温度(室温60℃、70℃、90℃、100℃)、提取时间(1.0h、2.0h、2.5h、3.0h、4.0h)作为单因素,考察各单因素对穿破石总黄酮得率的影响。1.2.7正交试验正交试验在单因素试验基础上,确定正交设计的各变量,以总黄酮得率为考察指标,通过正交分析对提取条件进行优化。2结果与分析2.1标准的芦丁工作曲线由1.2.4所示方法进行测定,由图1可得回归方程:A=5.736C+0.024R2=0.99942.2单因素试验的结果2.2.1黄酮总量温度对黄酮总量的影响以浓度90%,物料比为1:3,回流1小时。如图2所示由图可知穿破石黄酮总量温度的升高而增加,在温度升到90℃时黄酮总量最高,之后会逐渐降低。2.2.2乙醇浓度对降低黄酮消耗的影响以温度为70℃,物料比为1:3,回流1小时。如图3所示如图所示当乙醇浓度为90%时,提取的黄酮总量是最高的。2.2.3提取时间对黄酮含量的影响以温度90℃,物液比为1:3,回流1小时。如图4所示由图4可知,2.5个小时是最佳的提取时间,穿破石总黄酮随着提取时间的增加而增加。到2.5个小时后,再逐渐减少。2.2.4物液比的提取用15克穿破石分别以1:2,1:3,1:4,1:5,1:6的物液比提取。以70℃、70%乙醇热回流1h。如图5所示,物液比在1:2时穿破石黄酮含量最高。2.3热回流法黄酮的正交试验结果以表1所示的条件设计L9(34)正交试验,每组试验以15g原料计,试验结果如表1所示。正交试验结果在单因素试验的基础上,对热回流法黄酮的主要因素(即物料比、乙醇浓度、提取温度、提取时间)进行L9(34)正交试验,各水平因素见表1,试验结果如表2。由表2可知,提取温度、乙醇浓度、提取时间、物料比、四种因素对黄酮提取量影响的主次顺序为:物料比﹥乙醇浓﹥提取温度﹥提取时间,而最优秀的提取条件组合为:物料比1:2,乙醇浓度80%,提取温度90℃,提取时间提取温度90℃,提取时间。2.3最佳条件的合理性和可靠性在优化组合条件下,进行了三次平行验证性试验,以考察最佳条件的合理性和可靠性,结果如表3所示。由表3可知,在优化条件下,三次测量结果非常接近,说明该提取工艺稳定,适合于提取穿破石黄酮类化合物。3乙醇浓度和提取温度对黄酮提取率