中药复方对慢性约束应激大鼠下丘脑内啡肽的影响

中药复方对慢性约束应激大鼠下丘脑内啡肽的影响

作为一种重要的抗癫痫药物，它在大脑中很常见。主要分布在大脑、杏仁核和中隔。乾隆年间，也有大面积的神经退行性疾病，但没有神经退行性疾病。在垂体中期和前部，呈浓度较高的垂直组织中的肾上腺、胃关节、脾脏和胎盘。在疼痛和应激反应中,β-EP从垂体前叶释放至循环中,但它很快被血液蛋白酶所降解。血浆β-EP是下丘脑、垂体分泌的一种神经内分泌激素,在应激反应时增高。前期实验用放射免疫方法检测大鼠下丘脑β-EP的变化及中药复方的影响,结果21天模型组其含量明显上升,而中药复方能逆转这种变化。在此基础上,本实验选用免疫组织化学结合图像分析技术,进一步观察大鼠下丘脑β-EP的变化及中药复方的调节作用。材料和方法1.实验分组及模型构建SD雄性大鼠,体重为(200±20)g,购自北京维通利华实验动物研究中心,合格证号:SCXK-京2002-0003。大鼠适应3天后开始分组,进行正式实验。实验分组:A组,正常对照组;B组,7天模型组;C组,21天模型组;D组,模型加逍遥散防治组(简称逍遥散组,下同);E组,模型加四君子汤防治组(简称四君子汤组,下同);F组,模型加金匮肾气丸防治组(简称肾气丸组,下同)。每组各10只动物,每笼5只群养,饲养于清洁级动物房,室内温度保持为(22±2)℃,相对湿度保持为30%～40%,各组大鼠喂常规饲料,自由进食饮水。2.君子汤、金保持丸、金充气丸制备实验所用的中药复方分别选用《太平惠民和剂局方》中的逍遥散(北柴胡15g,当归15g,白芍15g,白术15g,茯苓15g,炙甘草7.5g,生姜5g,薄荷5g);四君子汤(党参15g,白术7.5g,茯苓7.5g,炙甘草5g)和《金匮要略》中的金匮肾气丸(干地黄30g,山药15g,山茱萸5g,泽泻7.5g,茯苓7.5g,牡丹皮7.5g,桂枝5g,炮附子5g)。上述中药饮片均购自北京同仁堂药店,由中日友好医院制剂室严格按照工艺制成药粉备用,用时根据需要用蒸馏水配制成一定的浓度。3.动物的饲养与饲养大鼠束缚架为木制结构。底座宽10cm,长20cm,厚1cm,上面束缚台长22cm,宽6.6cm,前端有固定大鼠头部的小架,两边有适合四肢放置的凹槽,上端有两条可调节的软带,分别固定大鼠的胸部和腰部。大鼠饲养于清洁级动物房,每笼5只,自然光照,每日每笼大鼠给300g饲料。以慢性束缚方法制作应激大鼠模型,将大鼠束缚于特制的鼠束缚架上,每日3h,共3周。4.免疫组化染色给药方法:自造模第1日始,D、E、F组每日分别灌服逍遥散、四君子汤、金匮肾气丸,按人体用药量换算成大鼠等效剂量作为大鼠用药量,3组的给药量分别为5.82g/kg、2.62g/kg和4.89g/kg,灌胃容积为1ml/100g体重,并根据体重随时调整给药量。A、B、C组则灌服等体积的蒸馏水。B组于第1周后取材,其他各组3周后取材。造模过程中,注意观察大鼠外观形态、进食量及体重等变化。取材:造模3周后,将大鼠称重,各组大鼠用10%水合氯醛麻醉后(剂量300mg/kg),经左心室至升主动脉插管快速灌入冷的200ml生理盐水,继以冷的4%多聚甲醛300ml灌注固定。在放有冰块的搪瓷盘中迅速剪开大鼠颅骨,取出脑组织,置10%甲醛中,4h后放入20%的蔗糖中,待组织下沉。用LEICA-CM1900型衡冷低温切片机取冠状切片,片厚50μm,留取包括背侧海马最大断面和顶叶皮质的切片,裱贴于预先经10%多聚赖氨酸(购自北京中山生物技术有限公司)处理过的载玻片上,空气中干燥后置于-70℃冰箱中。免疫组织化学染色程序:采用SP法。切片经室温平衡后主要步骤如下:10%的正常山羊血清室温孵育30min,封闭非特异性结合位点;倾去羊血清,加入用1%BSA稀释后的兔抗β-EP(稀释度1∶100,Sigma公司产品),37℃孵育1h,然后4℃孵育72h;用0.01mol/L的PBS漂洗3次,每次5min;加入生物素标记的羊抗兔IgG(北京中山生物技术有限公司),室温孵育30min;用0.01mol/L的PBS漂洗3次,每次5min;加入链霉素卵白素标记的HR,室温孵育30min;用0.01mol/L的PBS漂洗3遍,每次5min;加入DAB显色试剂,镜下控制显色时间;充分漂洗、干燥后用中性树胶封片。置换实验:用正常兔血清代替第1级抗体孵育切片。空白实验:省去第1级抗体,以PBS代替孵育切片。图像分析:采用TN-8520型图像分析系统(美国TracorNorthern公司),对糖皮质激素受体(GR)免疫阳性细胞进行定量检测。每组随机测试6张切片,每个部位测试1个视野分别测量。所有切片均在同一放大倍数(10×20)、同一光强度下分析,每张切片分别测定海马CA1区、齿状回、大脑皮质Ⅳ、Ⅴ层,各测相同面积内的阳性反应细胞。分析:阳性反应细胞平均总面积(particlearea,μm2);阳性反应细胞平均光密度(meanopticaldensity,MOD);阳性反应细胞数(numberofparticle)。5.组间差异统计分析统计学分析运用Excel、SPSS等软件进行,数据以x¯±sx¯±s表示。组间差异采用方差分析(ANOVA);以P<0.05作为差异存在统计学意义的界限。大鼠机械模型的表达1.β-EP免疫反应阳性神经元的一般形态与分布β-EP阳性纤维和终末在大脑和间脑内,颜色呈棕黄色,主要位于胞浆内,胞核着色较浅,背景颜色更浅;阳性反应细胞多分布在隔区、杏仁核和下丘脑的室周核、弓状核、背内侧核以及腹内侧核。2.下丘脑β-EP免疫反应阳性细胞平均光密度、平均总面积、平均细胞数目比较与正常组(A组)相比,7天模型组(B组)未见明显差异,21天模型组(C组)大鼠下丘脑β-EP免疫反应强度、阳性细胞数目及阳性细胞平均总面积均明显增强、增多、增大;与21天模型组(C组)比较,逍遥散组(D组)及肾气丸组(F组)能显著降低下丘脑β-EP免疫反应阳性强度,减少下丘脑β-EP免疫反应阳性细胞数目,减小下丘脑β-EP免疫反应阳性细胞平均总面积;而四君子汤组(E组)与21天模型组比较没有明显差异。见表1。3.对照实验以正常兔血清代替第1级抗体孵育切片和以PBS代替第1级抗体均为阴性反应。血浆-内啡肽和脑啡肽应激失调可引起心身疾病和精神疾病,但与机体的素质(体质、健康状态)有很大关系。当人们面对强大的精神刺激,不幸的生活遭遇和不能调节自己时,某些人出现躯体方面疾病,而某些人则出现精神神经疾病。对机体的损害主要表现在心血管系统、消化系统、免疫系统和神经精神系统这四个系统。其中神经精神系统疾病主要包括几个类型:心身疾病、神经官能症、精神分裂症和有关的精神病、躁狂—抑郁病。阿片肽是1975年发现的第一种肽类神经递质,它包括内啡肽、脑啡肽(enkephalin,EnK)和强啡肽(dynorphin,DYN)等。目前已有许多实验证明阿片肽在免疫调节中有重要作用,甚至有人称这类肽为神经免疫肽。它的主要功能可能是机体在各种应激条件下,通过心血管、疼痛和免疫功能的作用在更高的水平上作复杂的调节,使机体保持稳态。许多应激原(手术、分娩、电剌激、注射内毒素、放血、脊髓损伤等)都可引起人血浆β-内啡肽明显增多,达正常的5～10倍。血浆β-内啡肽水平的升高程度与促肾上腺皮质激素(ACTH)平行。β-内啡肽和ACTH(含39个氨基酸残基)、α-MSH(黑细胞刺激素)是同一前体阿片样肽黑素皮质激素原(proopiomelanocortin,POMC)的衍生物。β-内啡肽和ACTH都在下丘脑CRF的剌激下分泌入血,都受血浆糖皮质激素的反馈调节。输入β-内啡肽可降低血中ACTH和皮质醇的水平,而输入阿片受体拮抗药纳络酮(naloxone)则能使血中ACTH、β-促脂解激素(β-lipotropin,β-内啡肽的前体)和皮质醇的水平升高,提示β-内啡肽能调节ACTH的分泌,并且与ACTH一起经过短反馈或长反馈回路来抑制下丘脑CRF的分泌。β-内啡肽有很强的镇痛作用。应激镇痛(应激时痛阈值的升高)可部分地为纳络酮所取消,可能与β-内啡肽增多有关。β-内啡肽与脑啡肽、强啡肽合为阿片肽,其经典功能是内源性镇痛作用,它还介导应激对诸如情绪、精神状态的影响,这一现象亦受到学者们的广泛关注。大量的研究资料表明,内阿片系统及其受体在应激调节中起着不可忽视的作用。研究证明,脑内含β-EP的阳性神经元胞体主要存在于下丘脑的弓状核和孤束核的尾侧部,其纤维可以投射到脑内的许多部位。神经元在胞体内先合成β-EP的前体物质——阿黑皮素原,在轴突运输过程中,经多个步骤再加工成有活性的β-EP,储存于神经纤维和终末的大颗粒小泡内。当受到应激、损伤等刺激时,β-EP释放,并和脑内的阿片受体结合产生效应。由此看出,β-EP在脑内神经纤维、终末的分布及含量的变化可间接反应β-EP在脑内的合成和释放状况。内啡肽在不同形式的应激中,主要在血液动力学和内分泌起重要作用。有实验报道电击足底应激时,血浆β-内啡肽含量显著升高,而下丘脑、室周组织、垂体前叶中的β-内啡肽含量均下降。从而提示是否对于不同外界刺激会影响不同部位β-内啡肽水平,同时束缚应激对此影响是否有一定的时程特性。内源性阿片肽与下丘脑—垂体—肾上腺轴(HPA轴)关系密切,其中在垂体水平与β-内啡肽与ACTH来源于同一前体,共受下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)类物质的调节。本实验结果表明,与正常组相比,